西安交通大学医学院第一附属医院(西安 710061)

吕飒美* 吴友伟* 薛 挥△

血红素氧合酶-1(HO-1)是生物体内催化血红素分解过程中一种关键的限速酶,具有重要的生物作用。近年来发现,其在细胞应激及组织损伤防治中发挥着一定的作用,我们在成功建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型基础上,探讨 HO-1是否可以减轻肝脏缺血再灌注损伤及其相关作用机制。

材料和方法

1 实验材料 实验动物:选用西安交大医学院动物实验中心提供的SD雄性大鼠 77只,体重200～275g。主要试剂:Hemin Znpp均购于美国Sigma公司;SOD测定试剂盒及MDA测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所,兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体及DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

2 缺血再灌注模型建立 大鼠禁食 12h后,氯胺酮80mg/kg腹腔内注射麻醉。建立原位肝I/R模型:取上腹正中切口,入腹后分离肝十二指肠韧带,充分显露第一肝门部,用无损伤血管夹夹闭肝中叶和左外侧叶的肝动脉、门静脉,以造成70%的肝脏缺血模型,但不阻断肝右叶、尾状叶血流,以防胃肠道淤血及再灌注后肠道内的细菌和内毒素回流入肝脏对实验结果造成的不良影响。当缺血30min后,松开血管夹,恢复缺血肝叶的入肝血流。N组仅剖腹取血及肝组织,S组入腹后只游离肝门血管,不阻断肝门血供,于术后第 6h、12 h取血及肝组织;I/R组及I/R+hemin组、I/R+Zn PP组均进行I/R手术,并分别再灌注后第6h、12h处死动物,取血、切取肝左叶组织,分别用于各项指标测定、组织学检查。

3 实验分组 实验动物分为5组,每组6只。①正常组(N);②假手术组(S);③手术组(I/R):游离肝门血管,分清供应肝左叶和中叶的肝动脉和门静脉,肝脏缺血 30min,再灌注 6h和12h;④手术给药组(I/R+hemin),术前 24h、12h大鼠腹腔注射 hemin(氯铁血红素),每次 30μmol/kg体重,余同手术组;⑤手术给药组(I/R+ZnPP),术前 24h、12h大鼠腹腔注射ZnPP,每次 10μmol/kg体重;其余各组予等量生理盐水腹腔注射。其中S组、I/R组、I/R+hemin组和I/R+ZnPP组再各分为缺血再灌注后 6h及12h两个亚组。

4 观察项目 ①血清肝脏酶学指标检测:手术后6h、12h下腔静脉取血分离血清用全自动生化分析仪检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)。②锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、丙二醛(MDA)的测定。③免疫组化染色检测肝组织caspase-3的表达,以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性细胞,用Motic Med 6.0医学病理图像分析系统对图象进行采集和分析。灰度值数值越小,表明阳性表达越多。

5 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计学分析,实验数据用均数±标准差(±s)表示,各组间比较进行单因素方差分析(One-way ANOVA),P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠血清 ALT、AST检测结果 见表1,表2。肝脏缺血再灌注后I/R组与S组相比,术后6h和12h时血清 ALT、AST明显增高(P＜0.01),术前给予 hemin,则在再灌注 6h、12h时,血清ALT、AST均比同期 I/R组血清ALT、AST水平降低(P＜0.01),术前给予Zn PP,则在再灌注6h、12h时,血清ALT、AST均比同期 I/R组血清 ALT、AST水平增高 (P＜0.01)。

表1 各组大鼠血清 ALT活性(U/L,±s)

表1 各组大鼠血清 ALT活性(U/L,±s)

注:a P＜0.01vs N组及S组,b P＜0.01 vs I/R组,c P＜0.01 vs I/R组。

表2 各组大鼠血清 AST活性(U/L,±s)

表2 各组大鼠血清 AST活性(U/L,±s)

注:a P＜0.01vs N组及S组,b P＜0.01 vs I/R组,c P＜0.01 vs I/R组。

12h 222.66±28.391055.33±172.01a695.66±141.48b1523.83±208.30c

2 各组大鼠血清MnSOD、MDA的检测结果 见表3,表4。缺血再灌注后,再灌注6h、12h时,I/R组血清MDA水平高于同期 S组(P＜0.01);给予hemin后,在I/R+hemin组和I/R组之间进行比较,发现再灌注6h、12h时,I/R+hemin组的血清 MDA水平低于同期I/R组血清 MDA水平(P＜0.05);给予 ZnPP后,在 I/R+ZAPP组和I/R组之间进行比较,发现再灌注 6h、12h时,I/R+ZnPP组的血清MDA水平高于同期I/R组血清 MDA水平(P＜0.05);I/R组和S组相比,在再灌注 6h、12h时,I/R组大鼠血清 MnSOD水平均比同期 S组降低(P＜0.05);I/R+hemin组与I/R组比较,发现再灌注 6h、12h时,I/R+hemin组的血清MnSOD水平高于同期 I/R组(P＜0.05);I/R+Zn PP组与I/R组比较,发现再灌注 6h、12h时,I/R+ZnPP组的血清MnSOD水平低于同期 I/R组(P＜0.05)。

3 肝组织caspase-3免疫组化染色结果 见表5。肝脏缺血再灌注后6h、12h时,I/R+hemin组与同期I/R组比较,发现 I/R+hemin组caspase-3表达减少(P＜0.05),I/R+ZnPP组与同期 I/R组比较,发现 I/R+Zn PP组 caspase-3表达明显增多(P＜0.01)。

表3 各组大鼠血清MDA水平(nmol/ml,±s)

表3 各组大鼠血清MDA水平(nmol/ml,±s)

注:a P＜0.01vs N组及S组,b P＜0.05vs I/R组(6h),c P＜0.01 vs I/R组(12h),d P＜0.05 vs I/R组。

12h 9.90±2.4414.99±2.8910.49±2.5918.36±2.55

表4 各组大鼠血清MnSOD水平(U/ml,±s)

表4 各组大鼠血清MnSOD水平(U/ml,±s)

注:a P＜0.01vs S组,b P＜0.05vs S组,c P＜0.01vs I/R组,d P＜0.05 vs I/R组。

表5 各组大鼠肝脏免疫组化切片caspase-3图像分析灰度值(±s)

表5 各组大鼠肝脏免疫组化切片caspase-3图像分析灰度值(±s)

注:a P＜0.01vs N组及S组,b P＜0.05vs I/R组,c P＜0.01 vs I/R组。

讨 论

肝脏 IR损伤是常见的临床病理过程,各种原因引起的休克、肝脏手术、肝移植等都可以引起肝脏 IR损伤。IR损伤机制是复杂的,涉及氧自由基、细胞凋亡、核因子-κB(NF-κB)激活、前炎性细胞因子和粘附分子的释放、细胞能量不足、内皮素与一氧化氮失衡、细胞内钙超载等方面。国外学者[1]认为肝脏缺血再灌注损伤分为2个阶段,在再灌注早期(2h内)氧化应激是其主要特征,枯否细胞释放细胞因子及氧源性自由基(Oxygenderived free radicals,ODFR)。导致肝脏的急性损伤;再灌注后期(6～48h)是由中性粒细胞活化和聚集导致的炎性期,活化的中性粒细胞释放炎性细胞因子、活性氧、弹性蛋白酶等加重肝细胞损伤[2]。

MDA是脂质过氧化的产物,常被用于细胞脂质过氧化损害的指标。锰超氧化物歧化酶(SOD)的基本功能是保护细胞免受氧化应激,通过岐化反应清除超氧自由基。本研究发现肝脏缺血再灌注后,hemin组ALT、AST均明显降低,ZnPP组ALT、AST均明显增高;另外,I/R与S组比较,血清 Mn SOD水平降低,MDA水平增高,说明 I/R后体内抗氧化能力受损,氧自由基产生增多,肝组织脂质过氧化损伤明显,应用hemin组血清 MnSOD水平降低减少,MDA生成减少,应用 Zn PP组血清 MnSOD水平显著降低,MDA生成明显增加,以上说明HO-1可以提高机体抗氧化能力,具有减轻肝脏缺血再灌注所引起的脂质过氧化损害和保护肝细胞的作用。

caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,被称为“凋亡的执行者”[3]。Sass等[4]证实HO-1在细胞因子和CD95所介导的肝损伤模型中,可以有效抑制肝细胞凋亡的损伤。Katori等[5]在研究大鼠心脏移植过程中发现,应用HO-1诱导剂钴卟琳增加 HO-1表达,可引起抗凋亡基因 Bcl-2和Bag-1的表达,从而抑制移植心脏的细胞凋亡,而联合应用 HO-1抑制剂锌外琳则可逆转钴卟琳引起的抗细胞凋亡作用。本实验亦发现肝脏缺血再灌注后,I/R组caspase-3的表达明显高于S组,表明肝脏缺血再灌注中确实存在细胞凋亡,I/R+hemin组与I/R组比较caspase-3表达明显减少,I/R+Zn PP组与I/R组比较caspase-3表达明显增多,表明HO-1可以减少缺血再灌注后细胞凋亡。

HO是近年发现的在人体内多种组织和器官中存在的一种抗氧化酶,它是一种具有催化能力的应激蛋白,催化分解血红素生成CO、胆绿素和自由铁,具有抗细胞凋亡、抗氧化、传导信号和调节免疫的作用。胆绿素及其还原产物胆红素是体内丰富的抗氧化物质,Foresti等[6]在细胞培养液中加入胆红素可明显增强细胞抗氧化损伤能力,Fondevila等[7]在大鼠肝缺血在灌注动物实验模型中证明胆绿素有增加门静脉血流、胆汁分泌量、改善微循环、减轻肝细胞损伤的作用,并将大鼠缺血原位肝移植生存率从 50%提高至90%～100%。HO-1的产物铁离子可诱导铁蛋白的合成,Balla等[8]的研究显示:铁蛋白具有抗氧化损伤和细胞保护功能。

既往国外文摘[9,10]提示:缺血再灌注时所产生的多种氧化物质可通过促使细胞凋亡而在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。本文结果与上述研究基本一致,由此推测,HO-1可能通过抗氧化损伤通路而抑制细胞凋亡,从而达到对肝脏缺血再灌注的保护作用,其中 HO-1的作用产物一氧化碳、胆绿素、胆红素和铁可能发挥着重要作用[11]。

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[4] Sass G,Soares MC,Yamashita K,etal.Heme oxygenase-1 and its reaction product,carbon monoxide,prevent inflammation-related apoptotic liver damage in mice[J].Hepatology,2003,38:909-18.

[5] Katori M,Buelow R,Ke B,etal.Heme oxygenase-1 overexpression protects rat hearts from cold ischemia/reperfusion injury via an antiapoptotic pathway[J].Transplantation,2002,73:287-92.

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[7] Fondevila C,Shen XD,Tsuchiyashi S,etal.Biliverdin therapy protects rat livers from ischemia and reperfusion injury[J].Hepatology,2004,40:1333-41.

[8] Balla G,Jacob HS,Balla J,etal.Ferritin: a cytoprotective antioxidant strategem of endothelium[J].JBiol Chem,1992,267:18148-53.

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