第四军医大学西京医院病理科(西安 710033)

王映梅 曲 萍* 铁 茹* 张学策* 于军* 陈宝莹△

白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是一种促炎症因子,参与到多种疾病如心血管病、肥胖、2型糖尿病等的发生、发展过程[1]。IL-6由多种细胞产生,包括活化的白细胞、内皮细胞及脂肪细胞。人类脂肪组织分泌大量 IL-6,这些 IL-6占循环中 IL-6总量的10%～35%,是肥胖引起的血中IL-6升高的主要来源[2]。肥胖人群循环系统中氧化应激标志物的量增多,而且增加的氧化应激主要是由于脂肪组织中氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)产生的增多。ROS可以导致组织及体外培养的脂肪细胞中 PAI-1、TNF-α和IL-6等脂肪分泌因子的表达升高[3],但具体的调节机制并不清楚。因此,本实验利用体外诱导、分化的脂肪细胞,观察 ROS对 IL-6表达的调节,并进一步探讨可能参与其中的信号转导通路,为相关疾病的干预治疗提供依据。

材料与方法

1 材 料 PD98059,SB203580及SP600125均购自 Sigma(Saint Louis,MO,USA);AG490及Akt抑制物(Akt inhibitor)购自 Calbiochem(San Diego,CA,USA);过氧化氢(H2O2)(Sigma,St.Louis,MO,USA);Trizol Reagent及ImProm-II反转录试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)。多重免疫分析系统(Bioplex-Plex 100 suspension array system,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。

2 方 法(1)细胞培养及分化:3T3-L1细胞培养、诱导分化方法,及其活性检测在我们以往的报道中有详细描述[4]。(2)重组病毒感染 3T3-L1脂肪细胞:表达无活性 Akt的重组病毒(dominant-negative Akt,DN-Akt)由 Prof.K.S.Lam提供(香港大学内科系)。完全分化的3T3-L1脂肪细胞接种于6孔板,培养24 h后,加入用含 2%胎牛血清的DMEM稀释的重组病毒(200 pfu/cell),培养 3h,再加入同体积的含10%胎牛血清的DMEM,继续培养 24 h之后,去除培养液,PBS冲洗细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养。该实验以表达荧光素酶(luciferase,Luc)的病毒载体作为对照。(3)定量 PCR检测基因表达水平:利用 Trizol提取3T3-L1细胞内总 RNA,使用 Im Prom-II反转录试剂盒将1μg RNA反转录成cDNA。以此 cDNA为模板,18s核糖体RNA作为内参照检测目的基因的表达水平。定量 PCR体系采用 2×TaqMan Master Mix及20×TaqMan引物和探针(Applied Biosystems)。检测系统采用 Applied Biosystems Prism 7000序列检测系统,并利用 ABI Prism 7000 SDS软件进行分析。(4)多重免疫分析及夹心 ELISA法检测蛋白表达水平:多重免疫分析采用 Bio-plex 100悬浮分析系统(Bio-plex 100 suspension array system)及XY平台(XY Platform,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。在不同时间点收集3T3-L1脂肪细胞的条件培养液,用小鼠脂肪分泌因子检测试剂盒(St.Charles,MI,USA)检测培养液内PAI-1的蛋白水平,同时 PAI-1的量也采用 ELISA的方法检测。

3 统计学处理 所有实验均至少独立重复3遍。数据以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用 t检验,多组间比较采用方差分析。P值小于0.05被认为具有统计学差异。

结 果

1 H2O2升高 3T3-L 1脂肪细胞 IL-6的表达 为了观察氧化应激对脂肪细胞表达 IL-6的影响,本实验采用不同浓度的H2O2(0.2mmol/L,0.5mmol/L,1mmol/L),作用于3T3-L1脂肪细胞不同时间。提取细胞总 RNA,采用定量 PCR的方法,检测 IL-6的mRNA水平。低剂量的H2O2(0.2 mmol/L)就可以引起IL-6表达的改变,并且随着剂量的增加,其变化程度逐渐加大(图1A)。H2O2作用6h后就可以检测到IL-6 mRNA水平的明显升高,在 18 h时达到峰值(图1B)。此外,本实验观察了H2O2对3T3-L1脂肪细胞合成及分泌IL-6的作用。收集3T3-L1脂肪细胞在不同时间点的条件培养液,采用夹心 ELISA及多重免疫分析的方法检测 IL-6在培养液中的水平。结果显示,IL-6在H2 O2作用6h后就升高到对照组的4倍,到18h即升高到对照组的7倍(图1C)。

图1 H2 O2升高 3T3-L1脂肪细胞 IL-6的水平

2 H2O2影响 IL-6表达的可能信号转导通路为了探讨 H2 O2对 IL-6的调节机制,分化的3T3-L1脂肪细胞用或不用蛋白激酶抑制剂预处理 30 min,其后H2O2(0.5 mmol/L)作用 24h。提取细胞总 RNA,用定量 PCR的方法检测 IL-6的mRNA表达水平。蛋白激酶抑制剂包括:Akt抑制剂(Ak tinhibitor,20μmol/L)、ERK1/2抑制剂(PD98059,50μmol/L)、JAK/STAT 抑制剂(AG490,25μmol/L)、JNK抑制剂(SP600125,10μmol/L)及p70S6K抑制剂(Rapamycin,RA,1μmol/L)。Akt抑制剂部分抑制H2O2引起的IL-6的升高(图2A)。为了排除 Akt抑制剂的非特异性作用,本实验用一种表达无活性 Akt(Dominant negative Akt,DN-Akt)的重组病毒感染3T3-L1脂肪细胞(200 pfu/cell),因为这种无活性 Akt的表达可以竞争抑制细胞内野生型Akt的作用。之后,再将感染了病毒的细胞用 H2O2(0.5 mmol/L)刺激 24 h。由图2A可见,DN-Akt与Akt抑制剂有类似的作用。ERK1/2抑制剂(PD98059,50μmol/L)完全逆转H2O2引起的IL-6的升高(图2B)。AG490是 JAK/STAT信号通路的抑制剂,仅能部分逆转 H2O2对 IL-6表达的上调(图2C)。本实验并没有观察到 JNK抑制剂(SP600125,10μmol/L)在 H2O2调节 IL-6表达过程中的作用(图2D)。p70 S6K抑制剂(Rapamycin,RA,1μmol/L)单独作用于3T3-L1脂肪细胞时,可以轻度升高IL-6的mRNA水平,而且更加剧了H2O2上调IL-6的作用(图2E)。以上结果表明:Akt、JAK/STAT及ERK1/2参与H2O2对于IL-6的调节过程中。

图2 一些蛋白激酶对 3T3-L1脂肪细胞产生脂联素的影响

讨 论

氧化应激在肥胖、糖尿病及与其相关的一系列疾病的发生、发展中占有重要的地位。目前已知,聚集的脂肪组织中过多产生 ROS可以引起多种脂肪细胞分泌因子的异常表达[4],但其具体的机制并不清楚。我们的实验首先证实,H2O2作为一种重要的氧自由基,上调脂肪细胞的IL-6,并且具有浓度和时间依赖性。进而,对其可能的信号转导通路进行了初步筛查。

MAPKs(mitogen activated protein kinase)是一个蛋白激酶的大家族,它参与到多种病理生理变化中,尤其在启动细胞的应激反应、细胞增殖、分化及凋亡等方面占有重要的地位。它的三种最为重要的信号通路包括: ERK1/2、JNK1/2/3及p38(p38α/β/γ)MAPKs。以前的报道表明,在多种细胞中,氧自由基可以激活MAPKs[5]。本实验的结果表明 ERK1/2的抑制剂完全阻断了H2O2上调 IL-6的表达(图2B)。JNK的抑制剂对H2O2引起的IL-6的变化并没有明显影响(图2D),p38MAPK抑制剂的作用也并没有得出比较肯定的结果。这些提示 JNK和p38MAPK可能并没有参与到 H2 O2对 PAI-1的调节中。

Akt是一种具有多效性的信号分子,它是一种胰岛素信号转导通路及细胞增殖过程中重要的介导物。本实验发现,在 3T3-L1脂肪细胞中,H2O2作用15min就可以检测到 Akt明显的磷酸化激活,这与在其他细胞,如:NIH 3T3成纤维细胞、人胚胎肾 293细胞及HeLa细胞中的报道相一致[6]。提示Akt的激活参与到脂肪细胞对H2 O2的反应中。虽然Akt抑制剂仅能部分抑制 H2 O2导致的IL-6表达的升高(图2A),但它有可能也参与H2O2对 IL-6的调节。

p70S6K是PI3K的重要的下游信号分子,PI3K/p70S6K通路的激活影响细胞的蛋白质合成,而且对于细胞的生长有重要的意义,如,心肌细胞在轻度氧化应激情况下出现肥大与心肌细胞 p70S6K激活有关[7]。p70S6K的抑制剂 Rapamycin(RA)不但没有反转,反而更加剧H2 O2上调IL-6作用(图2E),这有几种可能的解释:首先,可能 p70S6K的激活对于IL-6的表达是一种抑制因素;其次,Rapamycin可能具有其他非特异性的作用,比如它可能影响了其他的信号分子,这种作用也可能是增加 H2O2诱导的IL-6轻度上调的原因之一。通过对于p70S6K抑制剂作用的分析,使我们注意到,在使用化学性的抑制剂进行实验时,必须要考虑到其可能存在的非特异性作用。因此,除了在实验中要注意对照组的设置以外,对于很多结论最好需要用其他的方法进行进一步的证实。如本实验中,每一种抑制剂都设立了抑制剂单独作用的对照组。为了进一步肯定结论,本实验还将一种表达无活性 Akt的病毒感染脂肪细胞,从而竞争抑制 Akt的活性,并与Akt化学抑制物的作用相比较,这样就有效的克服了仅应用化学抑制剂的局限性。

JAK/STAT信号通路可以被细胞内的ROS及外源性H2 O2所激活。在本实验中,JAK/STAT抑制剂则可以将其完全逆转(图2C),由于JAK是 STAT3的上游分子,因此 STAT3磷酸化水平的升高提示了JAK/STAT通路可能被激活,提示其参与H2O2对于IL-6的调节。

综上所述,H2O2可能通过活化 Akt、JAK/STAT及ERK1/2多种信号转导通路,剂量依赖性及时间依赖性地上调PAI-1。这为进一步深入研究脂肪分泌因子的调节机制提供了重要的线索,对于预防及治疗肥胖及其并发症提供了新的靶点。

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[4] 陈宝莹,魏经国,王 玮,等.氧自由基对脂肪细胞中脂联素表达的下调作用[J].心脏杂志,2008,20(2):142.

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