时成龙,侯玉杰,相文华,郭 巍,李红梅,赵立平,何剑斌

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150001)

马疱疹病毒 1型和4型是马鼻肺炎的病原,EHV-1主要导致妊娠马流产,还可引起呼吸道症状、马驹死亡和神经症状;EHV-4主要导致呼吸道症状,偶尔可引起流产。该病在全世界广泛分布,并对所有年龄和种类的马以及其他马属动物的健康构成严重威胁。1980年我国殷震、刘景华等人从东北两个马场的流产胎儿首次分离到马鼻肺炎病毒[1]。目前国际上检测该病的方法有很多,但国内对ELISA检测EHV抗体的报道很少[2-3],关于EHV分子生物学的研究也不多。本研究克隆EHV-1/4 gD基因同源性高且抗原性强的C端序列,并进行原核表达及纯化,对重组pET-gD蛋白进行免疫原性鉴定,为马鼻肺炎的检测工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 马疱疹病毒1型438/77株、马疱疹病毒4型405/76株、马胎皮肤细胞、EHV-1/4高免兔血清、DH5α、BL21及 pET-30a均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所马病研究中心保存。MEM及胎牛血清购自Gibco。H is-Tag M onoclonal Antibody、Anti-M ouse IgG、A nti-Rabbit IgG、A ntihorse IgG购自Sigma公司。

1.2 引物设计 根据GenBank上的EHV-1/4基因序列,应用DNAStar软件分析gD蛋白的抗原性及同源性,设计一对抗原性强且同源性较高的引物。GF ：5′-GGA TCCATGCGGATTGTTACT -3′(Bam H Ⅰ);GR ：5′-GGTCGACTTACGGGTCTGTTT-3′(SalⅠ)

1.3 病毒增殖 将EHV-1接种长成单层的马胎皮肤细胞上,吸附40min后加入含4%血清的维持液,置于37℃,5%CO2条件下培养。出现80%以上细胞病变时收毒,-70℃保存。

1.4 EHV-1 gD基因主要抗原区编码基因的扩增取250μL病毒,按Omega公司试剂盒操作说明提取病毒DNA,-20℃保存。取5μL EHV-1 DNA作为PCR模板进行扩增,退火温度54℃,时间40 s,30个循环。PCR产物进行琼脂凝胶电泳鉴定并经胶回收试剂盒回收。

1.5 表达载体pET-gD的构建 将PCR胶回收产物与pET-30a质粒分别用Bam HⅠ和Sa lⅠ双酶切并回收目的片段,T4 DNA连接酶16℃过夜连接,转化至DH 5α,37℃培养12 h后,从 LB平板(50 μg/mL Kan)上挑单菌落,接种于 LB培养基(50 μg/mL Kan),37℃震荡培养 12 h,保存菌种,提取质粒用Bam HⅠ和SalⅠ双酶切鉴定,将鉴定结果为阳性的菌种送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。选取测序结果与目的片段序列相一致的阳性质粒并命名为pET-gD,并将阳性质粒转化至表达感受态BL21(DE3)。

1.6 阳性转化菌的诱导表达和表达产物的免疫印迹试验(Western blot)鉴定 将阳性转化菌接种于含LB培养基(50μg/mL Kan)中37℃震荡过夜培养。次日以1%量接种于5mL LB培养基(50μg/mL Kan)中37℃震荡培养至OD600约为0.6时分别加入 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mmo l/L 的 IPTG 进行诱导培养,在诱导2 h、4 h、6 h、8 h和过夜分别取样进行SDS-PAGE分析。

超声波处理后经SDS-PAGE并转膜,4℃封闭过夜,次日分别加入首抗His-Tag M onoclonal Antibody,二抗 Anti-Mouse IgG。用 Western blot超敏发光液显色。

1.7 蛋白表达形式鉴定及蛋白纯化 将阳性转化菌接种于50mL LB培养基(50μg/mL Kan)中培养,OD值约为0.6时开始诱导表达,4 h后收获菌体细胞,用5mL 1×PBS重悬,超声波处理细胞重悬液至清亮,4 000 r/min(4℃)离心10min,分别收获沉淀和上清液,经SDS-PAGE检测表达蛋白的存在形式。

切下目的条带并研磨[4],浸于1 mL蛋白浸出液中4℃过夜,次日回收液体,SDS-PAGE鉴定并用BCA方法测定蛋白含量。

1.8 重组蛋白抗原性的鉴定 分别用本实验室已制备的兔抗EHV-1/4高免血清为首抗,Anti-Rabbit IgG为二抗,Western blot以鉴定纯化蛋白的反应原性。

1.9 间接ELISA检测 使用纯化后的重组pET-gD蛋白1μg/mL浓度包被,4℃过夜。次日洗涤后用含5%脱脂乳的PBS 37℃封闭2h,将待检马血清按1∶100稀释,每个样品做3个平行样,37℃作用1 h,洗涤后将Anti-horse IgG 1∶10 000稀释加入并37℃作用1 h。再洗涤加入含0.4 mg/mL OPD的底物缓冲液,避光显色15 min,加入H2SO4终止反应,用酶标仪492 nm波长测定OD值。

1.10 临床样品检测 利用本试验初步建立的马鼻肺炎间接ELISA方法对全国不同地区的383份马血清样本进行检测。初步调查了全国部分地区马鼻肺炎的感染情况。

2 结果

2.1 目的基因的扩增及重组质粒的鉴定 提取EHV-1病毒总DNA,应用设计的引物PCR扩增出大小为685 bp的片段。

挑取表达载体转化菌落,振荡培养后提取质粒,应用Bam HⅠ和Sa lⅠ酶切鉴定。结果表明目的片段已经插入pET-30a载体中。

2.2 阳性转化菌的表达优化及纯化 不同时间和不同浓度IPTG诱导表达产物的SDS-PAGE结果表明,时间从2 h到过夜和IPTG浓度从0.2～1.0 mmol/L均可有效诱导目的蛋白,但以 IPTG0.8 mmol/L诱导4h的效果最佳(图1、图2)。表达产物的大小约为35 kDa,与预期蛋白分子量一致,占总菌体蛋白含量约为55%。在最佳条件下进行大量诱导,超声破碎后收集上清及沉淀,SDS-PAGE表明重组蛋白为包涵体形式,并进行切胶纯化(图3)。

图1 0.8 mmol/L ITPG浓度时不同时间诱导蛋白表达

2.3 表达产物的Western blot检测 纯化后的pET-gD融合蛋白分别与兔抗EHV-1/4阳性血清反应后,均在35 kDa处出现特异性条带(图 4),Western blot结果表明,纯化后的该蛋白具有反应原性。

2.4 表达产物的间接ELISA检测 间接ELISA检测结果显示,重组的pET-gD蛋白能到与EHV马阳性血清发生反应,而不与健康马血清、EAV马阳性血清、JEV马阳性血清、EIV马阳性血清发生反应(图5)。

2.5 全国各地区马鼻肺炎的检测 应用本试验表达的蛋白初步建立的间接ELISA诊断方法对全国部分地区的马鼻肺炎样品进行检测,结果表明,383份马血清样本中83份血清的马鼻肺炎抗体呈阳性,血清阳性率为21.67%(见表1)。

图5 间接ELISA分析纯化的重组pET-gD蛋白

表1 全国部分地区马鼻肺炎的感染情况

3 讨论

EHV-1/4大多数糖蛋白镶嵌在病毒囊膜上,作为纤突蛋白突出于病毒粒子表面。是诱发体液免疫反应和细胞免疫反应的主要病毒蛋白[5],其中5个糖蛋白(gB、C、D、H 、L)上含有重要的病毒中和表位,在感染马内产生针对EHV-1/4的抗病毒血清学反应,而gD诱导的保护反应最为强烈[5-6]。本试验选取目的片段为EHV-1/4 gD基因主要抗原区域C端序列,而且具有非常高的同源性。构建的阳性克隆pET-gD表达产物用Western blot进行抗原性分析,兔抗 EHV-1、EHV-4高免血清均能与EHV-1 gD基因表达的产物反应,结果表明,EHV-1 gD基因C端的原核表达产物具有EHV-1、EHV-4型共同抗原。说明了 EHV-1 gD原核表达产物可作为ELISA包被抗原。利用重组pET-gD蛋白建立的ELISA与病毒中和试验具有非常高的符合率[2]。Doll E R和Bryans JT(1962)等认为病毒中和抗体可维持6～12个月甚至更长时间,因此应用EHVgD-ELISA可检出较高的阳性率[7]。

2010年,在我国举行亚运会,农业部对赛马引进及本地马匹血清学检测工作非常重视。目前,国际上已有重组蛋白建立的间接和单抗阻断ELISA技术,用来检测和区分EHV-1和EHV-4血清型的产品[7-9],但进口试剂盒价格过于昂贵,所以我国自主研发检测方法也正在进行中。本试验为我们进一步开发拥有自主知识产权的能检测和区分EHV-1/4的ELISA试剂盒提供了充分的基础[9-10]。

[1] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社,1997：988-1081.

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[3] 时成龙,侯玉杰,相文华,等.马鼻肺炎病毒主要糖蛋白及其功能[J].动物医学进展,2009,30(12)：1-3.

[4] 于在江.切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分析[J].生物技术,2007,3(17)：46-48.

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