李峤珂,吴雪琼,阳幼荣,梁 艳,张俊仙,李 楠,叶丽萍,梁建琴,王安生,张广宇,张 涛,王 兰

100091

2.武警四川省总队医院内一科,乐山 614000;

3.解放军第三O九医院消化科,北京 100091;

4.解放军第三O九医院血液科,北京 100091

目前结核病仍旧是人类所面临的最严重的传染病之一,早发现、早诊断、早治疗在结核病的防控中就显得十分重要。目前肺结核患者的诊断主要依据病人临床表现、影像学检查以及痰涂片查找抗酸杆菌,而痰涂片的阳性率偏低,分枝杆菌培养一般需4～8w,阳性率也较低;常用的血清学诊断、结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验等辅助诊断方法存在很多不足,如PPD皮肤试验的灵敏度在活动性肺结核中为 70%～80%,而在播散病例中则低于50%,此外,PPD是多种抗原的混合物,所含的抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗(BCG)所共有,PPD皮肤试验并不能鉴别结核分枝杆菌感染者和卡介苗接种者、环境分枝杆菌感染者,因此,PPD皮肤试验诊断结核感染的灵敏度低,特异性差。目前结核分枝杆菌感染的诊断缺乏金标准。

ELISPOT技术具有高特异度和灵敏度,已被国外广泛应用于结核分枝杆菌潜伏感染的检测〔1-4〕。目前英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT TB试剂盒是应用结核分枝杆菌特异的6 k Da早期分泌性抗原靶(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)多肽刺激结核致敏 T淋巴细胞分泌γ干扰素(IFN-γ),并应用ELISPOT方法检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞〔1〕。本研究应用CFP10/ESAT6融合蛋白作为刺激剂,建立了新的ELISOPT技术检测结核分枝杆菌感染的方法,检测健康体检者、非结核疾病患者和临床确诊的初治结核病患者,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 对象

1.1.1 正常对照组 解放军第三O九医院健康体检者30例,年龄 18～22岁,平均年龄19.2岁。

1.1.2 非结核疾病组 消化内科及血液科住院病人38例,其中确诊为消化道溃疡 11例,白血病8例,慢性胃炎4例,胆囊炎4例,肠梗阻3例,结肠息肉、消化道肿瘤、再生障碍性贫血和骨髓异常增生综合征各2例;男性22例,女性16例,年龄19-81岁,平均年龄51.9岁。

1.1.3 结核病组 全军结核病研究所确诊初治结核病40例,其中肺结核27例,肺结核合并胸膜炎8例,肺结核合并肠结核4例,结核性胸膜炎1例;其中18例痰涂片抗酸染色阳性或痰培养结核分枝杆菌阳性,肺结核合并糖尿病3例;男性24例,女性16例,年龄14～72岁,平均年龄37.6岁。

1.2 主要仪器设备及试剂 (1)美国CTL公司酶联斑点分析仪:由CTL公司中国销售部提供免费检测;(2)96孔细胞培养板:美国MILIPOR公司产品;(3)CFP10/ESAT6融合蛋白:由本研究所提供〔5〕;(4)结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD):北京祥瑞生物制品有限公司;(5)链亲和素-碱性磷酸酶:美国 Promega公司;(6)5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(nitro blue tetrazolium,简称NBT)底物:美国Promega公司;(7)人 IFN-γ捕获抗体和人IFN-γ检测抗体:美国R﹠D公司;(8)植物血凝素(PHA):美国Sigma公司。

1.3 ELISPOT检测方法

1.3.1 包被微孔板 每孔加入50μL 1∶60稀释的IFN-γ捕获单克隆抗体,4。C冰箱过夜。

1.3.2 外周血单个核细胞分离及计数 取3～4 mL外周抗凝血,用淋巴细胞分层液分离、提纯单个核细胞(PBMC),调节细胞浓度至2.0×106/L。

1.3.3 分泌IFN-γ的T细胞检测 每个测试样本需要微孔板4孔:在阴性对照孔内加入完全细胞培养液50μL;在阳性对照孔内加入阳性对照PHA 50μL;在2个测试孔内分别加入CFP10-ESAT6融合蛋白50μL。分别在上述各孔内,加100μL含有2×105个PBMC的悬液,将微量板置于37。C含5%C02孵箱中孵育20h;弃培养上清,用 200μL 1×PBS洗板4次,1min/次;每孔加入 50μL 1∶60稀释的IFN-γ检测抗体,37。C孵育2h;洗板后,每孔加入50μL 1∶1 000稀释的链亲合素-碱性磷酸酶,室温孵育 2h;洗板后,每孔加入50μL新鲜配制的BICP/NBT底物,显色15min;可见板底显示紫色斑点,用蒸馏水洗板中止反应。每1个点代表1个分泌γ干扰素的T细胞,应用CTL公司酶联斑点分析仪计数着色的斑点。

1.3.4 结果判断标准 阴性孔和阳性孔起质控作用,如阴性孔点数＞10,说明可能存在细菌污染;如阳性孔斑点数＜20,说明可能存在细胞数量或活力不足。取PPD皮试阴性的正常人的(检测孔SFC数-阴性对照孔SFC数)平均值+2s作为阳性判断标准,因此,当阴性对照孔点数＜8,检测孔点数减去阴性对照孔点数≥8,可判断所检测标本为阳性;如果阴性对照孔点数≥8,检测孔点数为阴性对照孔两倍,可判断所检测标本为阳性。

1.4 PPD皮肤试验方法 吸取PPD 0.1mL(5IU),采用曼图氏法注射于前臂掌侧皮内。于注射后72h检查注射部位反应。若硬结的横径及纵径的平均数≥5mm为阳性。

1.5 统计分析 采用SPSS11.0统计软件进行分析。计数资料以率表示,进行χ2检验,P＜0.05有统计学意义。两两样本率的比较采用χ2分割法,P＜0.01有统计学意义。

2 结 果

2.1 建立ELISPOT检测结核分枝杆菌感染的方法 为了研究ELISPOT方法的适宜实验条件,比较结核病人 1×105、2×105、3×105的 PBMC 经CFP10/ESAT6融合蛋白刺激后分泌IFN-γ的细胞斑点数,结果显示2×105以上的PBMC可产生理想的细胞斑点;由于应用2×105个细胞数时,结核病患者检测孔的斑点数足够多又不很密集,便于计数;而应用3×105个细胞数时,结核病患者检测孔的斑点数多而密集,不好计数;此外,3×105的PBMC需要抽取更多的外周血,因此确定2×105个PBMC为每孔细胞数。比较PBMC与CFP10/ESAT6融合蛋白共同孵育10h、20h、30h后所产生的分泌IFN-γ的细胞斑点数,结果显示孵育20h和30h均可获得满意的结果;选取2×105个结核病人PBMC,比较PBMC 与 10μg/mL、20μg/mL 、40μg/mL CFP10/ESAT6融合蛋白共同孵育 20h后所产生的分泌IFN-γ的细胞斑点数,结果显示20μg/mL 和40μg/mL抗原浓度无明显区别。因此,本研究确定ELISPOT方法的实验条件为:PBMC为2×105个,CFP10/ESAT6融合蛋白浓度为 20～40μg/mL,孵育时间为20h。

2.2 应用ELISPOT方法与PPD皮试方法检测结核感染的结果比较 应用PPD皮试方法及ELISPOT方法检测108例人血样本的结果见表1。PPD皮试检测30例健康体检者、38例非结核疾病患者和40例结核病患者的阳性率分别为40.0%、0%、72.5%,而ELISPOT检测的阳性率分别为20.0%、10.5%、92.5%。3组阳性率经列表卡方检验,差异有统计学意义(χ2=59.79,P＜0.05)。将各组的阳性率采用χ2分割法检验,正常对照组与结核疾病组差异有统计学意义(χ2=38.03,P＜0.01),正常对照组与非结核疾病组差异无统计学意义(χ2=1.20,P＞0.05),结核疾病组与非结核疾病组差异有统计学意义(χ2=52.52,P＜0.01)。将40例结核病患者的ELISPOT检测结果与PPD皮肤试验结果进行四格表卡方检验(见表2),两组间检测结果有显著性差别(χ2=4.08,P＜0.05)。

表1 应用PPD皮肤试验和ELISPOT方法检测108例人血样本的结果Table 1 The result of 108 samples detected by PPD skin test and ELISPOT

2.3 应用ELISPOT方法与传统细菌学方法检测结核病患者的结果比较 将40例结核病患者的ELISPOT检测结果与痰涂片或痰培养的检测结果进行四格表卡方检验,痰菌阳性组ELISPOT的灵敏度为94.4%,痰菌阴性组ELISPOT的灵敏度为90.9%,两组间ELISPOT检测结果无显著性差异(χ2=0.002,P＞0.05),见表 3。

表2 结核疾病组ELISPOT方法与PPD皮试方法检测结果的比较Table2 Comparison of 40 TB patients detected by PPD skin test and ELISPOT

表3 结核疾病组ELISPOT检测与痰菌检查结果的比较Table3 Comparison of 40 TB patients detected by sputumsmear or-culture and ELISPOT

3 讨 论

近年来的研究发现,ESAT6和CFP10是由RD1区编码,该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中,所有卡介苗菌株及大多数非致病性分枝杆菌基因组中均缺乏该区域〔6-7〕。因此,ESAT-6和CFP-10可作为结核分枝杆菌感染的特异性T细胞刺激抗原。经美国FDA批准上市的T-SPOT TB试剂盒是应用一系列ESAT-6和CFP-10多肽刺激T淋巴细胞分泌γ-干扰素〔3〕,由于一系列多肽合成的费用高,使试剂盒成本和检测费用增高。Hill等〔4〕的研究表明 ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为T淋巴细胞刺激剂可取得同样的检测效果,本文采用CFP10/ESAT6融合蛋白进行ELISPOT检测的结果也证明了这一点,但通过基因工程大量制备重组蛋白的费用却明显低于多肽的合成,故本方法极大地降低了检测的费用。

本试验用ELISPOT检测40例临床已确诊结核病患者的灵敏度(92.5%)显著高于 PPD(72.5%),与 Codecasa等〔8〕的研究结果相似 。国外文献报道应用ELISPOT方法检测活动性肺结核的敏感性可达到78%～100%,特异性可达到80%～100%〔9〕,在HIV阳性的结核病患者中其敏感性也可达到90%〔10-11〕。由于结核潜伏感染者的诊断缺乏金标准,无法评价PPD皮肤试验和ELISPOT的特异性,不能排除ELISPOT阳性而PPD皮肤试验阴性者为结核潜伏感染者的可能。本文非结核疾病对照组中包括消化系统疾病、血液病和肿瘤患者,以及老年人,可能部分患者由于免疫功能低下,导致PPD皮肤试验假阴性,而ELISPOT方法不受患者免疫功能的影响,仍可检测出10.5%的结核潜伏感染者。30例正常对照组的PPD和ELISPOT阳性率分别为40.0%和20.0%,我国第四次全国结核病流行病学调查结果显示PPD皮肤试验的阳性率为45.5%〔12〕,与本文相似,而ELISPOT 的阳性率显著低于PPD皮肤试验很可能是因为卡介苗接种者被排除了,因此,ELISPOT检测结果可能反映的是我国真正的结核菌感染率,也就是说,目前我国的结核菌感染者可能并没有那么多。

我们对痰菌阳性与阴性结核病人的ELISPOT检测结果分析表明,菌阳和菌阴结核病患者的灵敏度无显著性区别,这对于临床上大部分痰菌阴性的结核病患者及肺外结核病患者的诊断具有重要的实际意义,可作为痰菌阴性结核病辅助诊断的重要方法。另外,ELISPOT在HIV感染者、免疫力低下者、儿童结核和肺外结核的检测中也可获得满意的结果〔13-14〕。

在本试验的技术操作中应注意一些问题,固相支持物的选择和准备,试验过程中细胞的分离和孵育,试验中试剂的用量,抗体的浓度,剂量及每次作用时间都会造成背景和敏感性的差异,故需建立规范化的技术标准。总之,CFP10/ESAT6融合蛋白作为抗原应用于ELISPOT法检测结核分枝杆菌感染有较高的灵敏度和特异度,可能成为结核分枝杆菌感染的一项重要的筛查工具,并辅助结核病诊断。

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