方 强,夏 惠,王雪梅,齐文娟,常雪莲,高 琪

2.江苏省寄生虫病防治研究所、卫生部寄生虫病预防与控制技术重点实验室,无锡 214064

疟疾是一种严重危害人类健康的感染性疾病,目前全球40%的人口生活在疟疾流行区,有109个国家的约33亿人口受到疟疾感染的威胁,约2.47亿人罹患疟疾,死亡人数达88.1万〔1〕。间日疟原虫是对人类危害仅次于恶性疟原虫,据估计全球受到间日疟原虫感染威胁的人口高达26亿〔2〕,而每年约有0.8-3亿人因间日疟原虫感染而出现急性发作〔3-5〕。在我国,估计目前每年有70万左右疟疾患者,主要是间日疟患者,但在部分地区有间日疟原虫和恶性疟原虫的混合流行〔6-7〕。疟疾的诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节,当前疟疾的发病率和死亡率难以控制的一个重要原因就是在疟疾流行区缺乏有效的诊断和治疗手段。依据全球疟疾控制方案的规定,WHO全球方案执行研究组特别强调早期诊断和正规治疗的重要性〔8〕。鉴于病原检测方法及PCR方法在疟疾诊断中均存在一定的局限性,免疫快速诊断方法近年来在疟疾防治研究领域得到了高度重视。

疟原虫乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途径的末端酶,在整个红内期均存在,是疟原虫生长所必须的酶。由于其具有不同于人类红细胞 LDH的独特理化和免疫化学性质,故在疟疾诊断和新药筛选方面具有重要的应用价值。目前国内外对于恶性疟原虫乳酸脱氢酶已经有较多的研究,已有以其为诊断靶抗原的诊断试剂投入现场使用,而对于间日疟原虫乳酸脱氢酶的研究却较为滞后。直到2004年Brown WM与Turgut-Balik D先后报道了Salvador I株LDH的部分基因序列和Belem株的LDH 全基因序列〔9-10〕,国内亦于06年报道了云南的PvLDH 的部分序列〔11〕。但中国PvLDH编码区全长基因序列却一直未见报道。我国的疟疾流行以间日疟为主,克隆可望作为诊断靶抗原的PvLDH编码区全长基因对于建立新的疟疾快速免疫诊断方法,进行疟疾防治防治有着重要的意义。为此,我们采用基因克隆技术,扩增了来自中国安徽间日疟原虫LDH编码区全长基因,将其克隆至pMD18-T载体进行序列测定,并利用生物信息学在线工具对序列进行分析并做B细胞表位预测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 间日疟原虫 采自安徽省蚌埠市经厚薄血片染色镜检和PCR检查确诊为单纯间日疟原虫感染,尚未进行药物治疗,年龄≥18岁,非孕妇且体温≤39.5℃的间日疟患者。在告知实验目的并签署知情同意书后静脉采血5～10mL,肝素抗凝,37℃水浴保温,2h内运送至实验室。

1.1.2 菌种和质粒 pMD18-T载体为T aKaRa产品,大肠杆菌DH5α由本室保存。

1.1.3 试剂 TRIzol试剂为 Invitrogen公司产品,cDNA合成试剂盒为Fermentas公司产品(#K1621),PrimeSTARTMHS DNA聚合酶为 TaKa-Ra产品,Tap DNA 聚合酶、dNTP、100bp plus DNA Ladder和 1kb DNA Ladder均为 Fermentas公司产品。胶回收试剂盒、质粒小抽试剂盒为Axygen公司产品。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.4 PCR引物 根据GenBank数据库中间日疟原虫Belem株 LDH基因序列(登录号：DQ060151)设计一对引物,上游引物为ATG ACG CCG AAA CCC AAA ATT G,下游引物为：TTA AAT GAG CGC CTT CAT CCT TT T AG,引物由上海英骏公司合成,PAGE纯化。

1.2 方法

1.2.1 间日疟原虫的浓集和总RNA的提取 将间日疟患者血样分离血浆后以不完全1640稀释为20%红细胞悬液,以60%Percoll浓集含虫红细胞,按T rizol试剂盒说明书提取细胞总RNA,分别用紫外分光光度法测定总 RNA的纯度和浓度,1.2%TBE琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量,选取高质量的RNA进行逆转录。

1.2.2 总RNA的逆转录 按照Fermentas公司的RevertAidTM第一链 cDNA合成使用说明书操作：其中在20 μ L反应体系中,间日疟原虫总 RNA量为 3～ 4 μ g,oligo(dT)18为引物 ,M-MuL V 逆转录酶进行逆转录,所得间日疟原虫cDNA立即进行PCR或-20℃保存待用。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR)以获得的间日疟原虫cDNA为模板,扩增反应体系总体积为 50 μ l。扩增反应条件为：预变性 94℃5 min;然后94℃1 min,56℃1 min,72 C 1 min,30个循环;最后 72℃延伸10 min。用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检验扩增产物。

1.2.4 PCR产物的TA克隆 PCR产物琼脂糖凝胶电泳后以胶回收试剂盒回收,加A尾,根据使用说明书要求与pMD18-T载体连接,将连接产物转化 DH5α感受态细胞,平铺入含 Amp 、Xgal、IPTG的LB琼脂平板进行蓝白斑筛选。

1.2.5 克隆鉴定及序列测定 分别挑取多个白色单菌落,放入2 mL含Amp的LB液体培养基中,37℃＞200 r/min 8 h,提取质粒DNA。以提取的质粒DNA为模板,分别以上述引物进行PCR扩增鉴定阳性克隆;根据T载体和目的DNA所含的酶切位点,分别对提取的质粒DNA进行单双酶切鉴定。将经鉴定的阳性克隆菌送上海生工进行序列测定。

1.2.6 序列分析 利用NCBI提供的生物信息学在线工具对测序结果进行同源性分析。

1.2.7 B细胞表位预测 利用在线工具http：//tools.immueepitope.org/tools/bcell/iedb_input对推导的PvLDH氨基酸序列进行分析,预测其二级结构、表面可及性、亲疏水性、抗原性、蛋白柔韧性,综合预测其线性B细胞表位,并与据PfLDH氨基酸序列预测的线性B细胞表位进行比较分析,预测PvLDH特异性线性 B细胞表位;并分析预测的PvLDH特异性线性B细胞表位在PvLDH蛋白空间结构的定位。

2 结 果

2.1 总RNA的质量 提取的总RNA A260/A280为1.8-2.0,琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA条带清晰锐利,无降解弥散,质量较好。

2.2间日疟原虫LDH编码区全长基因的扩增 用两条引物从制备的中国安徽间日疟原虫RNA逆转录产物扩增LDH编码区全长基因,PCR产物经1%琼脂糖电泳显示在约950bp处有一特异性扩增条带,片段大小与预期结果(951bp)一致,见图1。

图1 间日疟原虫LDH PCR产物琼脂糖电泳分析M：DNA 标准;1：PCR产物Fig.1 Agarose gel electrophoresis for PCR products of PvLDHM：DNA marker;1：PCR products

2.3 LDH编码区全长基因重组质粒的鉴定 挑选的阳性克隆菌落PCR扩增出951bp片段,提取质粒做单酶切则见1条约为4 000bp条带,双酶切后见2条分别约为3 000bp和1 000bp条带。表明目的基因已成功克隆入T载体,见图2。

图2 pMD18-PvLDH重组质粒的酶切及PCR鉴定M：DNA标准;1：pMD18-PvLDH重组质粒 HindⅢ和BamHⅠ双酶切;2：pMD18-PvLDH 重组质粒 HindⅢ单酶切;3：pMD18-PvLDH重组质粒PCR产物Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-PvLDH by restriction digestion and PCRM：DNA marker;1：recombinant plasmid pMD18-PvLDH digested by HindⅢ and BamHⅠ;2：recombinant plasmid pMD18-PvLDH digested by HindⅢ;3：PCR products usingrecombinant plasmid pMD18-PvLDH as template

2.4 序列测定及同源性分析 测定的中国安徽间日疟原虫LDH基因的全编码区基因长为951bp,无内含子,A+T/G+C含构成比为509∶442,预测编码316个氨基酸,分子量为34kD。该基因已经上传GenBank,收录号为GU078391。以 BLASTn对获得的中国安徽PvLDH基因序列进行同源性分析,结果表明我们获得的中国安徽PvLDH与间日疟原虫Sal-I株和Belem株LDH基因比较同源性达99.9%(950/951),仅在666位处发生 1个G→C点突变,且其编码氨基酸无变化,为同义突变。运用BLASTp对中国安徽PvLDH基因推导的氨基酸序列进行同源性分析,结果显示安徽PvLDH氨基酸序列与间日疟原虫Sal-I株和Belem株LDH同源性为100%,与其它疟原虫LDH的同源性分别为：诺氏疟原虫LDH预测序列为97%(307/316)、恶性疟原虫、伯氏疟原虫、约氏疟原虫均为90%(285/316)、夏氏疟原虫为88%(279/316)、三日疟原虫LDH已知序列为 90%(272/299)、卵形疟原虫LDH已知序列为88%(265/299)。而与艾美球虫、弓形虫、巴贝虫、泰累尔犁浆虫等其它原虫的同源性均小于60%。

2.5 线性B细胞表位分析 利用在线工具分析了推导的PvLDH氨基酸序列的二级结构、表面可及性、亲疏水性、抗原性、蛋白柔韧性,并据此预测其线性B细胞表位12个线性B细胞表位见表1、图3,与据PfLDH氨基酸序列预测的线性B细胞表位,见表2、图3,分析比较,获得一间日疟特异性线性B细胞表位：KITDEEVE,位于氨基酸序列的 208-215位。通过对预测表位在PvLDH蛋白空间结构中位置的分析,显示该预测表位位于PvLDH表面,见图4,与PvLDH蛋白(2A92)表面氨基酸匹配率为100%。

3 讨 论

疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)同宿主动物LDH在理化、免疫学特性和酶学方面有很大的差异。在催化乳酸生成丙酮酸反应中,pLDH能够迅速地利用NAD类似物3'-乙酰吡啶NAD(3-acetyl pyridine analog of NAD,APAD)作为辅酶,而红细胞LDH(LDHr)在APAD存在时参与这一反应速率很慢〔12〕;同时,pLDH 还具有种、属特异性,而且疟原虫的无性期和配子体均可产生该种酶,因而是检测疟原虫理想的靶抗原〔13〕。以恶性疟原虫乳酸脱氢酶作为恶性疟诊断的标靶的快速诊断试剂已经在世界范围内得以广泛的应用,并取得良好的效果〔14-17〕。对于间日疟原虫目前尚无特异性快速免疫诊断试剂〔17〕。而我国疟疾流行则以间日疟为主,因此,加强间日疟诊断标靶的研究具有十分重要的现实意义。鉴于我国的间日疟原虫的LDH全长基因尚未见报道,我们对克隆了分离自安徽间日疟流行区的LDH全长基因,并进行了序列分析。

图3 间日疟原虫LDH(a)和恶性疟原虫LDH(b)预测线性B细胞表位序列。黄色区域为预测的表位。Fig.3 B cell linear epitopes prediction of PvLDH(a)and PfLDH(b).The epitopes prediction shown in yellow

表1 间日疟原虫LDH和恶性疟原虫LDH预测线性B细胞表位序列Tab.1 B cell linear epitopes prediction of PvLDH and PfLDH

图4 预测的PvLDH特异性线性B细胞表位在PvLDH四聚体的空间位置黄色区域为预测的PvLDH特异性线性B细胞表位KITDEEVEA、B、C、D四图为 PvLDH 四聚体逆时针旋转,旋转90°Fig.4 Space location in PvLDH tetramer of the specific B cell linear epitopes prediction of PvLDH The specific B cell linear epitopes predicted of PvLDH show in yellowA,B,C,D show go degree counterclockwise rotations of PvLDH tetramen

本研究显示克隆的中国间日疟原虫安徽株LDH的基因序列与Belem株和Salvador Ι株的基因序列有高度的同源性,核苷酸序列仅有一处点突变,且为同义突变,其编码氨基酸序列的无改变。同已经登陆于GenBank的其它间日疟原虫虫株(如Belem株和Salvador Ι株)的LDH氨基酸序列一致的现象结合分析,表明不同虫株间日疟LDH具有高度的同源性。这种不同虫株间的间日疟LDH高度同源性更显示了其作为疟疾免疫快速诊断靶抗原的优势。同时,序列分析也显示在各种不同种的疟原虫LDH间也具有高度的保守性,但与艾美球虫、弓形虫、巴贝虫、人类等的LDH相比,则差异很大。利用免疫快速诊断方法进行疟原虫虫种鉴别诊断的关键是获得种特异性LDH单克隆抗体,而由于疟原虫LDH具有高度的保守性,以纯化的pLDH天然或重组蛋白免疫动物制备单克隆抗体,则获得疟原虫属共同抗原表位的单克隆抗体的几率远远高于获得间日疟原虫种特异性单克隆抗体的几率,筛选制备种特异性LDH单克隆抗体的难度是可以想象的。近年来,随着生物信息学技术的发展,表位预测手段日趋成熟,所预测表位的成功率大大提高,利用预测表位合成肽制备抗体已经成为一条可行的路线。因此,我们试图利用生物信息学手段来预测间日疟原虫LDH种特异性表位,为制备间日疟种特异性单克隆抗体做准备。为此,我们对间日疟LDH进行了线性B细胞表位预测,并与PfLDH线性B细胞表位进行对比分析。结果显示在2种LDH预测的潜在表位中大部分存在着共同的氨基酸序列,但值得注意的是间日疟 LDH氨基酸序列的208-215位KITDEEVE形成的B细胞表位在PfLDH不存在。因此,这是一个潜在的间日疟特异性B细胞表位。然而,目前该潜在的间日疟特异性B细胞表位仅是通过序列分析预测获得,尽管通过分析其在PvLDH蛋白上空间位置发现其在PvLDH蛋白表面,为预测结果提供了部分佐证,进一步增加了其作为B细胞表位的几率,但其是否真正具有抗原性,是否确为一个B细胞表位,还需要通过后续实验进行验证。若经证实其确为一个间日疟特异性B细胞表位,则可以之合成肽免疫小鼠,制备针对该表位的单克隆抗体,建立一种新的检测间日疟原虫的间日疟特异性诊断方法。

间日疟原虫LDH基因的成功克隆和间日疟特异性B细胞表位的成功预测,使我们有可能通过基因工程技术表达间日疟原虫的LDH蛋白或利用合成肽技术合成包含间日疟特异性B细胞表位的短肽,从而制备间日疟的种特异性抗体,为实现间日疟的特异性免疫诊断奠定基础。

〔1〕WHO,World M alaria Report[OL].2008.http：//apps.who.int/malaria/wmr2008/malaria2008.pdf.

〔2〕Guerra CA,Snow RW,Hay SI.Mapping the global extent of malaria in 2005〔J〕.Trends Parasitol,2006,22：353-358.

〔3〕Hay SI,Guerra CA,Tatem AJ,et al.The global distribution and population at risk of malaria：past,present,and future〔J〕.Lancet Infect Dis,2004,4：327-336.

〔4〕Price RN,Tjitra E,Guerra CA,et al.Vivax malaria：neglected and not benign〔J〕.Am J Trop Med Hyg,2007,77(6 suppl)：79-87.

〔5〕Mueller I,Galinski M R,Baird JK,et al.Key gaps in the knowledge ofPlasmodium vivax,a neglected human malaria parasite〔J〕.Lancet Infect Dis,2009,9(9)：555-566.

〔6〕中华人民共和国卫生部.2006-2015年全国疟疾防治规划,2006[OL].http：//www.chinacdc.net.cn/n272442/n272530/n273736/n273781/n320333/n3274976/12135.html.

〔7〕周水森,王漪,房文,等.2007年全国疟疾形势〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2008,26(6)：401-403.

〔8〕TDR.T hirteenth Programme Report〔R〕.WHO,Geneva,1997,41-61.

〔9〕Brown WM,Yowell CA,Hoard A,et al.Comparative structural analy sis and kinetic properties of lactate dehydrogenases from the four species of human malarial parasites〔 J〕.Biochemistry.2004,43(20)：6219-6229.

〔10〕T urgut-Balik D,Akbulut E,Shoemark DK,et al.Cloning,sequence and expression of the lactate dehydrogenase gene from the human malaria parasite,Plasmodium vivax〔J〕.Biotechnol Lett,2004,26(13)：1051-1055.

〔11〕郝文波,王萍,陈白虹,等.间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析〔J〕.热带医学杂志,2006,6(8)：873-876.

〔12〕MaUer M T,Ries JM,Williams JA,et al.Parasite lactate dehydrogenase as an assay forPlasmodium f alcipanrmdrug sensitivity〔J〕.Am J Trop Med Elyg,1993,48 ：739-741.

〔13〕Kaushal DC,Katuhak NA,Chandra D,et al.Monoclonal antibodies against lactate dehydrogenase ofPlasmodium knowlesi〔J〕.Indian J Exp Biol,1995,33：6-11.

〔14〕Palmer CJ,Lindo JF,Klaskala WI,et al.Evaluation of the OptiMAL test for rapid diagnosis ofPlasmodium vivaxandPlasmodium f alciparummalaria〔J〕.J Clin Microbiol,1998,36：203-206.

〔15〕Fogg C,Twesigy e R,Batwala V,et al.Assessment of three new parasite lactate dehydrogenase(pan-pLDH)tests for diagnosis of uncomplicated malaria〔J〕.T rans R Soc T rop Med Hyg,2008,102(1)：25-31.

〔16〕Sharew B,Legesse M,Animut A,et al.Evaluation of the perfo rmance of CareStart Malaria Pf/Pv Combo and Paracheck Pf tests for the diagnosis of malaria in Wondo Genet,southern E-thiopia〔 J〕.Acta T rop,2009,111(3)：321-324.

〔17〕Ashley EA,Touabi M,Ahrer M,et al.Evaluation of three parasite lactate dehydrogenase-based rapid diagnostic tests for the diagnosis of falciparum and vivax malaria〔J〕.M alar J,2009,8(1)：241.