王俊平，张伟伟，杜欣军，吴懿娜，董 峰，王 硕

（食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析

王俊平，张伟伟，杜欣军，吴懿娜，董 峰，王 硕*

（食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH），长度分别为324bp和360bp，将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序；根据测序结果设计特异性引物和连接序列（Gly4Ser）3，利用重叠延伸PCR扩增得到长度为729bp的单链抗体基因片段（scFv），亚克隆至原核表达载体pET30a（+），并转化感受态细胞BL21（DE3）进行诱导表达；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，重组表达单链抗体形成包涵体，分子量大小约为33kDa，变性后利用不同条件进行复性，结果显示最佳复性时间为48h，最佳起始蛋白浓度为200μg/mL，含有精氨酸的复性液效果最佳；利用亲和层析纯化scFv，并利用竞争ELISA检测其活性，结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。

西维因，单链抗体，克隆，表达，活性

西维因（Carbaryl）是氨基甲酸酯类农药的一种，广泛用于防治稻、麦、棉、果树、蔬菜等作物害虫，畜禽外寄生虫和卫生害虫。它是一种接触性杀虫剂，兼有内吸活性，如残留在体内，能抑制胆碱酯酶，使乙酰胆碱在组织中蓄积，进而导致流涎、恶心、流泪、瞳孔缩小、视力模糊、痉挛等，甚至造成致畸、慢性神经中毒等严重危害，其在作物和蔬菜上的农药残留会对人体健康造成较大的危害［1-2］。目前用于检测农药残留的方法很多，而酶联免疫技术以其灵敏度高，适合于检测大量样品以及成本低、无需大型昂贵仪器设备等优点，越来越受到欢迎［3］。为了建立西维因的酶联免疫分析方法，首先必须制备特异性好的抗体。而单链抗体是用基因工程方法将抗体的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）通过一段连接肽（linker）连接而成的重组蛋白，是保持了亲本抗体全部特异性和结合能力并具有最小的结构单位的小分子。scFv具有能在细菌中表达，易于基因操作和大量生产等优点，这对于西维因大规模检测及检测产品的产业化具有重要意义［4-5］。本实验从能分泌特异性西维因单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化西维因单链抗体的基因，并在大肠杆菌中进行高效表达，通过透析复性的方法获得具有抗原结合活性的单链抗体。

表1 scFv克隆所用引物

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西维因杂交瘤细胞 本实验室制备；总RNA提取试剂 上海博星基因芯片有限责任公司；反转录试剂盒 Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、pET30a（+）质粒载体、大肠杆菌BL21（DE3） Promega公司；His-Bind树脂 Novagen公司；西维因酶标抗原本实验室合成；PCR引物 上海生物工程公司合成。

PCR仪、SDS-GAGE系统、冷冻离心机 Bio-Rad公司；超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 VL、VH克隆及测序鉴定 从1×106个杂交瘤细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，用兼并引物分别扩增 VL和VH［6］，PCR反应条件为：94℃，5min；94℃，1min；53℃，1min；72℃，1min，循环35次；72℃，10min。电泳检测扩增结果，胶回收PCR产物。将回收产物连接到pGEM-T-Easy载体，经酶切鉴定与PCR鉴定后进行测序，并对测序结果进行分析鉴定。1.2.2 scFv基因片段克隆 根据测序结果，重新设计引物VLF和VLR，VHF和VHR（表1），分别从VL-pGEM-T-Easy质粒和VH-pGEM-T-Easy质粒扩增VL和VH片段，之后通过两步法将VL，VH进行重叠延伸获得scFv基因片段；将胶回收的VL和VH等量混合后加入50μL的PCR反应体系中，进行无引物延伸反应，反应条件为：94℃，1min；58℃，1min；72℃，1min，反应进行10个循环；反应后，向反应体系中加入引物VHF、VLR及Pfu DNA聚合酶进行第2步反应，反应条件为：94℃，1min；63℃，1min；68℃，1min，循环20次。电泳检测扩增结果。

1.2.3 重组表达载体构建与诱导表达 用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切胶回收的scFv，之后将其连接到同样双酶切的pET30a（+）质粒，转化感受态DH5a，筛选阳性克隆，提取质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。挑取抗性生长克隆增菌培养，并用0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），37℃，200r/min诱导5h。收集菌液进行SDS-PAGE检测。

1.2.4 包涵体复性的条件优化

1.2.4.1 包涵体的分离与变性 根据SDS-PAGE检测鉴定结果，取阳性克隆IPTG诱导培养，收集细菌。用超声方法破碎细胞。10000×g，4℃离心20min收集沉淀。沉淀用包涵体洗涤液A（50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）洗涤2次，用包涵体洗涤液B（50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，8mol/L脲，pH=8.0）洗涤2次，加入包涵体变性缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl，10mmol/L DTT，8mol/L脲，pH =8.0），37℃，200r/min，快速振荡1h。10000×g，4℃离心20min，收集上清［7］。

1.2.4.2 最佳复性条件的确定 用变性液将变性蛋白浓度稀释至200μg/mL，于50倍体积的复性液Ⅰ（0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）中4℃分别透析 12、24、36、48h，每 12h更换一次透析液。

用变性液将变性蛋白分别稀释至500、200、100、50μg/mL，于50倍体积的复性液Ⅰ（0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）中4℃分别透析48h。

分别在复性液Ⅰ中加入5mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH）和0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽（GSSG），5%甘油，0.4mol/L L-精氨酸（L-Arg），分别进行透析复性。

以上各方法透析产物经4℃，10000×g离心20min。Bradford法测抗体浓度，计算复性率。复性率计算公式：蛋白复性率（%）=复性后样品量/复性起始样品量×100%，最后采用最优条件进行透析复性。

1.2.5 scFv纯化与活性鉴定 按照试剂说明书步骤，过His-Bind亲和层析柱纯化复性蛋白，Bradford法测抗体浓度，SDS-PAGE检测纯化效果。

用竞争ELISA法分析纯化抗体的活性。

2 结果与分析

2.1 VL和VH基因扩增及测序

从西维因杂交瘤细胞中，利用小鼠抗体基因简并引物，分别PCR扩增单克隆抗体可变区VL和VH基因。将扩增得到的单链抗体基因进行序列测定，并对轻链和重链测序结果进行序列比对，结果表明克隆序列为小鼠抗体可变区基因片段，片段长度分别为324bp和360bp（图1）。

图1 VL、VH基因片段扩增M：DNA Marker；1：VH；2：VL。

2.2 scFv基因克隆

根据轻重链可变区测序结果重新设计轻、重链引物，运用重叠延伸法将轻、重链可变区连接形成scFv，片段大小为729bp（图2），核苷酸及氨基酸序列如图3所示。

图2 scFv PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳图

图3 西维因单链抗体scFv基因片段序列

2.3 重组表达

将单链抗体进行双酶切，与同样双酶切的pET30a（+）连接，再转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，进行PCR和酶切验证（图4）。

图4 重组表达质粒scFv-pET30a（+）鉴定

将重组质粒转化BL21（DE3），挑取单菌落进行诱导表达，SDS-PAGE显示目的蛋白存在于菌体破碎后的沉淀中，即形成了包涵体，分子量大小约为33kDa（图5）。

2.4 复性条件优化

2.4.1 复性时间的优化 分别测定不同复性时间下2：菌体破碎后的上清液；3：IPTG诱导后菌体；4：未诱导菌体。的蛋白复性率，可知在48h以上复性率差异不大（图6），由此确定最佳复性时间为48h。

图5 scFv在BL21（DE3）中诱导表达

图6 复性时间的优化

2.4.2 复性蛋白起始浓度的优化 分别测定不同起始浓度的复性率，可知复性率随起始蛋白浓度升高而降低，但由于总体复性量在200μg/mL时最高（图7），所以选择此起始蛋白浓度为最适蛋白起始浓度。

图7 复性起始浓度的优化

2.4.3 复性液组成成分进行的优化 分别测定复性率，可知L-Arg的添加对复性率有很大提高（图8），由此确定复性液成分为0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.4mol/L L-Arg，pH=8.0。

图8 复性液成分优化

2.5 scFv活性鉴定

2.5.1 复性抗体的亲和纯化 将包涵体进行破碎，洗涤，变性，在最优条件下（起始蛋白浓度为200μg/mL；复性液为0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.4mol/L L-Arg，pH=8.0；4℃复性48h）进行透析复性后，用Bradford法测抗体浓度约为40μg/mL菌液。再经 His-Bind树脂柱纯化复性的 scFv，SDS-PAGE显示纯化效果较好（图9）。

图9 scFv过His-Bind柱纯化效果

2.5.2 直接竞争ELISA 在聚苯乙烯酶标板上包被纯化抗体（1μg/well），室温下孵育过夜，洗涤后，加入不同稀释度西维因标样和相同稀释度酶标抗原（各100μg/well），室温下反应1h，洗涤后，添加150μL底物液，室温下显色20min，再添加50μL终止液，终止反应。在双波长方式（450/650nm）下用酶标仪读取OD值（图10）。

图10 西维因直接竞争ELISA鉴定结果

ELISA检测结果显示，吸光值随标品加入量的增加而降低，纯化后的scFv蛋白可以与其相应的抗原特异性结合。

3 讨论

包涵体复性的方法很多，目前常用的复性方法主要有稀释复性、透析复性和层析复性，而其中透析复性是实验室最常用的复性方法。由于影响蛋白复性的因素很多，如氧化还原体系、表达蛋白的浓度、复性的时间以及复性的温度等，不同的蛋白其复性条件需要具体摸索。本实验采用透析复性方法，将复性蛋白浓度调至200μg/mL，有效避免了链间二硫键的产生，同时在复性缓冲液中加入L-Arg，可非特异性结合于错配二硫键和不正确折叠结构，降低其稳定性，并使之逐渐转变成正确折叠。实验对scFvpET30a（+）蛋白复性条件的确定只是初步的，对于如何大量获得高纯度有活性的目的蛋白，还有待于进一步摸索更为有效的复性方法［8-10］。

由于单链抗体是单价抗体，只有一个抗原结合位点，其稳定性和亲和力都较天然抗体低，并且只能与一种抗原特异性结合，功能单一，为此可将单链抗体进行进一步改造，以提高其活性和功能。例如将scFv中二个可变区之间的接头缩短，迫使二个分子间的VL和VH配对形成双价抗体，其结合性能优于单价分子。如果将两种不同特异性的可变区基因交叉配对，则可得到双特异抗体［11-13］。

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Cloning，expression and activity analysis of single chain variable fragment（scFv）against carbaryl

WANG Jun-ping，ZHANG Wei-wei，DU Xin-jun，WU Yi-na，DONG Feng，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Variable regions of ligh（t324bp）chains（VL）and heavy（360bp）chains（VH）of antibody genes were cloned from hybridoma that secreting specific antibody against carbaryl using generate primers.The VLand VHwere cloned into pGEM-T-Easy and sequenced.Specific primers synthesized based on the sequenced fragments were used to amplify single chain variable fragment（scFv）which was composed of 729bp.The scFv was subcloned into pET30a（+）and transformed into E.coli BL21（DE3）for recombinant expression.Polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）results indicated that the recombinant expressed scFv formed inclusion bodies and the molecular weight was about 33kDa.Different renaturation conditions were selected to obtain more soluble proteins and the results demonstrated that 48h，200μg/mL initiative protein concentration and renaturation reagent containing arginine were the optimal conditions for renaturation.His-Bind resin was used to purify scFv.The purified recombinant antibodies presented good affinity and specificity base on competitive ELlSA.

carbaryl；scFv；cloning；expression；activity

Q789

A

1002-0306（2010）11-0161-04

2009-11-04 *通讯联系人

王俊平（1969-），男，副教授，博士，研究方向：食品安全管理与风险评估。

国家高技术研究发展计划（2006AA10Z448）；国家自然科学基金（20905058）。