邢 玲，江 华

（南京林业大学化学工程学院，江苏南京210037）

木聚糖酶对玉米芯酶水解过程的影响

邢 玲，江 华*

（南京林业大学化学工程学院，江苏南京210037）

研究了稀酸预处理过的玉米芯酶水解过程中，木聚糖酶的补充对葡萄糖、木糖得率的影响。结果表明：玉米芯的酶水解过程中，添加适量的木聚糖酶，可提高葡萄糖和木糖的生成速度，但是，酶解24h之后，木聚糖酶的这种强化作用基本消失，此时葡萄糖和木糖生成速度基本上与初始酶用量无关。在总蛋白质含量不变的情况下，采用含等量蛋白质的纤维素酶和木聚糖酶所构成的混合酶系，明显地比单一等量蛋白质的纤维素酶提高了单位蛋白质的产糖率，有利于降低酶解成本。在纤维素酶量为5～35FPU/g（干原料）范围内，适宜的木聚糖酶添加量为60IU/g（干原料）；在其他条件相同情况下，分别采用35FPU/g（干原料）的纤维素酶和混合酶系［15FPU/g（干原料）的纤维素酶与60IU/g（干原料）木聚糖酶混合］时，72h时的糖得率（葡萄糖和木糖）几乎相等，因此，采用纤维素酶和少量的木聚糖酶的混合酶系可明显地降低纤维素酶的使用量，降低酶解成本。

木聚糖酶，纤维素酶，玉米芯，强化作用

随着经济的持续增长，能源的需求不断攀升，化石能源的渐趋枯竭，人们越来越认识到寻求清洁、可再生能源的迫切性。燃料乙醇是重要的可再生能源之一，过去，世界上许多国家的燃料乙醇的生产均以糖类或粮食为原料，燃料乙醇的产量受到粮食资源的限制，难以长期满足人类对能源的需求［1］。可再生的植物纤维（包括各种农林废弃物）是生产燃料乙醇的重要原料之一，但是，从技术和经济方面来说，植物纤维原料制备燃料乙醇工业化推广条件尚不成熟［2］。其中最为关键的技术之一是将植物纤维降解为可发酵的单糖。目前认为酶法水解植物纤维是有效利用植物纤维的重要手段，然而，天然状态的植物纤维很难被酶降解，为此，在酶水解之前，常常采用物理、化学或二者组合方法对植物纤维进行预处理。酸法预处理是研究最多的方法之一，这种预处理过程溶出了大部分的半纤维素，破坏了植物纤维的原始结构，增加酶对底物的可及性，提高了酶解效率［3-4］。然而，剧烈的预处理导致半纤维素转化为一系列的副产物，它们会抑制后续糖的发酵，或者增加后续的分离工艺难度；同时降低了植物纤维的利用效率。较为缓和的预处理可明显减少这些副产物的生成，有利于后续糖的发酵和植物纤维的高效利用，降低生产成本，但是，预处理条件缓和，半纤维素去除率下降，降低了纤维素酶对底物的可及性，为了消除半纤维素对纤维素酶的空间阻碍，可在纤维素酶水解植物纤维的过程中添加适当量的半纤维素酶，以便促进纤维素酶的水解速度，提高水解效率，同时有利于提高植物纤维利用率，简化生产工艺［5-6］。本文采用较温和的预处理条件（0.1%的稀硫酸浸渍1h、在120℃蒸煮1h）对玉米芯进行预处理，保留了其中的绝大部分半纤维素，通过添加木聚糖酶的方法，研究木聚糖酶对植物纤维原料酶水解过程的辅助作用。

表1 纤维素酶和木聚糖酶的活性测定

表2 玉米芯原料的主要成分分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米芯 产自苏北，粉粹至1～3mm；羧甲基纤维素（CMC） 天津柯密欧化学试剂开发中心，分析纯；微晶纤维素 上海源聚生物科技有限公司，分析纯；水杨苷 陕西慧科植物开发有限公司，分析纯；桦木木聚糖、Trichoderma reesei纤维素酶 sigma公司；Trichoderma viride木聚糖酶 Fluka公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米芯的预处理与成分分析

1.2.1.1 预处理 粉碎过的玉米芯经0.1%（w/w）的稀硫酸浸泡1h后，120℃下蒸煮1h，过滤，清水洗涤残渣至中性，40℃烘干备用。

1.2.1.2 原料分析 按文献［7］进行，本文用木聚糖的含量和转化率代表半纤维素的含量和转化率。所得结果均为三次实验的平均值，误差不超过5%。

1.2.1.3 HPLC分析 采用高效液相色谱（HPLC）法分析酶解液中糖浓度。色谱分析条件如下：色谱仪：Agilent1100型高效液相色谱仪；色谱柱：Aminex HPX-87P；柱温：80℃；流动相：脱气超纯水；流速：0.4mL/min；监测器：折光示差监测器；进样量：0.5μL。

HPLC测定方法：用双蒸水分别配制浓度为2、1、0.5、0.25g/L的葡萄糖和木糖标准溶液；在上述色谱条件下分析；根据糖浓度和峰面积的关系绘制标准曲线，得到标准曲线的方程；酶解液经HPLC分析后，经过标准方程的计算，得出葡萄糖和木糖浓度。

1.2.2 酶活力的测定 测定所有的纤维素酶活力、木聚糖酶活力时，还原糖的生成量均采用DNS法测定按文献［8］进行。对实验中使用的纤维素酶和木聚糖酶进行了活性分析，结果如表1所示。

1.2.3 玉米芯酶水解过程 称取1.0g预处理过的玉米芯置于50mL锥形瓶中，加入一定量的纤维素酶、木聚糖酶或两种酶的混合酶（所加入的酶量均以每克底物计算），同时再加入一定体积的0.05mol/L、pH4.8的柠檬酸-氢氧化钠缓冲溶液，使得固液比为1∶10，放入恒温振荡水浴中酶解，水浴振幅为80r/min，酶解温度为50℃。酶解一定时间后，取出、离心得上清液，将上清液稀释一定倍数后，用HPLC分别测定其中的葡萄糖、木糖浓度。所得结果均为三次实验的平均值，误差不超过5%。

2 结果与讨论

2.1 原料分析

表2给出了未经处理的玉米芯和稀酸预处理过的玉米芯中纤维素、半纤维素、酸溶木素和酸不溶木素以及热水抽提物的百分含量（均为100g绝干原料为基准）。

由表2可知，玉米芯经过0.1%稀硫酸、120℃下处理过1h之后，纤维素的含量从原来的31.02%增加到37.10%；热水抽提物含量从9.93%降低到1.26%；半纤维素含量和木素含量几乎没变。对于纤维素、半纤维素和木质素，半纤维素在酸性条件下最容易被水解，所以，玉米芯经稀酸处理之后，热水抽提物和部分半纤维素溶出，从而增加了纤维素的含量；但是由于上述预处理条件比较温和，仅有少量的半纤维素被溶出，其溶出量正好被热水抽提物去除量相抵消，从而使得半纤维素相对含量基本保持不变，结果表明，在这样的预处理条件下，保留了玉米芯原料中的绝大部分的纤维素和半纤维素。

2.2 葡萄糖得率与纤维素酶用量的关系

图1表明：当纤维素酶量小于15FPU/g时，随着纤维素酶量的增加，葡萄糖得率几乎呈线性增加，而当纤维素酶量从15FPU/g增加到25FPU/g时，糖得率的提高逐渐趋于缓慢；当纤维素酶用量大于25FPU/g时，葡萄糖得率几乎不再随纤维素酶量增加而增加，维持在51.2%左右。在底物浓度一定时，纤维素酶量增加，底物活性位点与酶分子碰撞几率增加，反应速度加快，所以，葡萄糖得率随之增加；但是，当酶量增加至一定程度后，底物中活性位点被纤维素酶饱和，因此，纤维素的转化率不再随纤维素酶量增加而增加。

2.3 玉米芯酶水解过程中转化率和单糖生成速度与时间之间的关系

在单一纤维素酶、纤维素酶和木聚糖酶的混合酶分别水解玉米芯过程中，葡萄糖和木糖得率以及葡萄糖、木糖生成速度与酶解时间之间的关系如图2所示，糖生成速度是由糖浓度对时间求一阶导数所得。

图2 酶解过程中转化率和糖生成速度随时间的变化

图2表明：无论采用单一的纤维素酶还是纤维素酶和木聚糖酶的混合酶，玉米芯酶解时纤维素和木聚糖转化率均随着酶解时间的延长而增加，在酶解反应的前24h过程中，纤维素和木聚糖的转化率增加较快。之后，转化率的增长开始减缓，这一结果与文献报道基本一致［12］。同时，图2表明，采用混合酶时葡萄糖、木糖得率随时间的变化规律与采用单一纤维素酶的类似，在纤维素酶用量为15FPU/g基础上添加100IU/g木聚糖酶时，酶解72h时的葡萄糖得率从49.5%增加到63.2%，得率提高了27.5%；而木糖得率从 35.6%提高到 44.8%，得率提高了25.8%。由此可见，纤维素酶水解玉米芯过程中，添加木聚糖酶不仅提高木聚糖的转化率，而且可以提高纤维素转化率，因此，纤维素酶水解过程中，补充适量木聚糖酶，可增加总糖回收率，提高底物利用率。

图2还表明，添加木聚糖酶能有效地提高糖的初始生成速度，在纤维素酶量为15FPU/g的基础上添加100IU/g木聚糖酶后，葡萄糖初期生成速度从0.48g/（L·h）提高到0.96g/（L·h）；木糖生成速度从0.43g/（L·h）提高到0.72g/（L·h），再根据图1结果，可以看出，随木聚糖酶带入的纤维素酶活力非常小（约为1.5FPU/100IU）不可能如此快速提高葡萄糖、木糖生成速度，因此，图2中葡萄糖和木糖生成速度、得率的提高源于木聚糖酶的补充，这表明木聚糖酶能强化植物纤维的酶水解速度。根据原料分析可知，玉米芯半纤维素主要为木聚糖，支链阿拉伯糖基含量很低（HPLC分析未能测得），因此，在酶水解过程中，添加适量的木聚糖酶可加快底物中木聚糖的水解，消除木聚糖对纤维素酶的阻碍作用，增加了纤维素对纤维素酶的可及性，使得葡萄糖生成速度得以提高。

另外，从图2还可以看出，随着酶解反应的进行，葡萄糖、木糖的生成速度迅速下降，而且木聚糖酶的强化作用越来越不明显。当反应进行到24h时，各条件下的葡萄糖生成速度下降到0.1～0.2 g/（L·h）之间，而木糖生成速度下降到0.1g/（L·h），此时，木聚糖酶的强化作用已经不明显，之后，两种糖生成速度再继续缓慢下降。出现这种现象的原因可能归咎于a.产物抑制作用；b.底物结构变化妨碍了酶的水解作用；c.酶组分的活力剧烈下降，至于哪方面的因素起主导作用，有待进一步研究。

2.4 添加等蛋白含量的木聚糖酶和纤维素酶对糖量的影响

为了考察补充木聚糖酶的经济性，在纤维素酶量为5FPU/g和15FPU/g的基础上，分别再添加与它们蛋白含量相等的纤维素酶或木聚糖酶，对预处理过的玉米芯进行酶解反应，48h时所产生的葡萄糖和木糖的质量如图3所示。

由图3可见，纤维素酶用量从5FPU/g增加到10FPU/g时，酶解 48h所产生的葡萄糖质量由102.2mg提高到136.8mg；如果在5FPU/g的纤维素酶中添加与该纤维素酶等蛋白质含量的木聚糖酶，此时48h所生成的葡萄糖质量即提高到187.5mg，可见，添加木聚糖酶比添加等蛋白质含量的纤维素酶多生成了37.1%的葡萄糖。纤维素酶用量从15FPU/g增加到30FPU/g时，酶解48h所生成的葡萄糖质量从156.2mg提高到187.3mg；如果在15FPU/g的纤维素酶中添加与该纤维素酶等蛋白质的木聚糖酶，此时48h所生成的葡萄糖质量提高到237.5mg，可见，添加木聚糖酶比添加等蛋白质含量的纤维素酶多生成了26.8%的葡萄糖。结果表明，在总蛋白质含量保持不变的情况下，使用含等量蛋白质的纤维素酶和木聚糖酶相混合所构成的酶系时，所产生的葡萄糖质量明显高于单纯使用纤维素酶时所产生的葡萄糖的质量。

图3 在一定纤维素酶基础上，添加与其等蛋白质含量的木聚糖酶时产糖量

在5FPU/g的纤维素酶基础上，分别添加与其等蛋白质含量的纤维素酶和木聚糖酶，48h酶解所产生的木糖质量由108.7mg分别提高到121.6mg和140.0mg，因此，添加木聚糖酶比添加等蛋白质含量的纤维素酶多生成了15.1%的木糖。同样，在15FPU/g的纤维素酶基础上，分别添加与其等蛋白质含量的纤维素酶和木聚糖酶，48h酶解所产生的木糖质量由84.2mg分别提高到104.4mg和118.5mg，因此，添加木聚糖酶比添加等蛋白质含量的纤维素酶多生成了13.5%的木糖。结果表明，混合酶系还促进了木糖的生成。因此，在总蛋白质含量不变的情况下，含等量蛋白质的纤维素酶和木聚糖酶所构成的混合酶系的酶解效率明显高于单一纤维素酶的酶解效率。因此，采用纤维素酶与木聚糖酶混合酶系时，单位质量蛋白质产糖量明显提高，有利于提高纤维素的酶解效率，降低植物纤维酶水解成本。纤维素酶水解植物纤维过程中，添加适量的木聚糖酶，有利于降解底物中半纤维素，减少空间位阻，使得纤维素酶更加容易吸附于纤维素上；另外，上述结果还可看出，添加含等量蛋白质的木聚糖酶之后，葡萄糖的生成速度比木糖生成速度提高得更快，这说明，消除底物中少量的半纤维素即可明显提高纤维素的酶水解速率。

2.5 木聚糖酶添加量对糖得率的影响

木聚糖酶添加量对72h时葡萄糖和木糖的酶解得率的影响如图4所示。由图可见，随着木聚糖酶添加量的增加，葡萄糖和木糖的得率均随之提高，而且，在低纤维素酶量情况下，添加木聚糖酶时，木糖和葡萄糖得率提高尤为明显，在纤维素酶量为5FPU/g基础上，添加60IU/g的木聚糖酶时，葡萄糖和木糖得率从 28.4%和 28.5%提高到 48.0%和37.1%，葡萄糖和木糖得率分别提高了 69.0%和30.2%；在纤维素酶量为 35FPU/g基础上，添加60IU/g的木聚糖酶时，葡萄糖和木糖得率从50.5%和37.8%提高到57.2%和41.9%，葡萄糖和木糖得率分别提高了13.3%和10.8%。同时，图4还表明，在15FPU/g的纤维素酶基础上，添加60IU/g木聚糖酶时，葡萄糖和木糖得率分别为51.3%和38.7%；而单一采用35FPU/g的纤维素酶时，葡萄糖和木糖得率分别为50.5%和37.8%，纤维素酶水解玉米芯时，添加适量的木聚糖酶有利于除去覆盖在纤维素表面的木聚糖，增强底物中纤维素对纤维素酶的可及性，提高葡萄糖得率。但是当木聚糖酶添加量超过60IU/g时，葡萄糖和木糖得率增加的不明显，由于半纤维素结构上的复杂性，单纯地添加木聚糖酶很难彻底地降解底物中半纤维素、提高纤维素酶对底物中纤维素的可及性，因此过多地添加木聚糖酶时，葡萄糖得率提高并不明显。可见，采用纤维素酶和少量的木聚糖酶的混合酶系，可明显地降低纤维素酶的使用量。同半纤维素酶相比，纤维素酶活力较低［12］，因此，采用两种酶的混合酶系，有望降低植物纤维酶水解过程的成本。这说明，植物纤维酶水解时，纤维素酶的滤纸酶活力的大小，不是决定酶水解速度的唯一因素，而与适合底物结构的酶系组成也是决定酶水解速率不可忽视的因素之一。

图4 木聚糖酶的添加量对葡萄糖和木糖得率的影响注：酶解反应条件：pH4.80，反应温度50℃，酶解时间72h。

3 结论

3.1 玉米芯的酶水解过程中，添加适量的木聚糖酶，可提高葡萄糖和木糖的生成速度，从而提高葡萄糖和木糖的得率，但是，酶解24h之后，木聚糖酶的这种强化作用基本消失，此时葡萄糖和木糖生成速度基本上与初始酶用量无关。

3.2 玉米芯的酶水解过程中，在5FPU/g和15FPU/g基础上分别添加与它们等蛋白质含量的木聚糖酶比添加相应量的纤维素酶多生成37.1%和26.8%的葡萄糖；而木糖多生成15.1%和13.5%。因此，在总蛋白质含量不变的情况下，采用含等量蛋白质的纤维素酶和木聚糖酶所构成的混合酶系，明显地提高了单位蛋白质的总产糖率，有利于降低酶解成本。

3.3 在纤维素酶量为5～35FPU/g范围内，木聚糖酶的适宜添加量为60IU/g，木聚糖酶添加量超过60IU/g时，葡萄糖和木糖得率提高不显著。采用纤维素酶和少量的木聚糖酶的混合酶系时，在保持酶解得率的条件下，可明显地降低纤维素酶的使用量。

［1］高凤芹，孙启忠，刑启明.木质纤维素乙醇的研究进展［J］.农业科技与信息，2009（4）：54-55.

［2］彭源德.纤维质生物降解制备燃料乙醇研究现状［J］.中国麻业科学，2009，31（1）：101-103.

［3］武琳，涂国全.玉米芯酶解糖化条件实验研究［J］.江西农业大学学报，2008，30（6）：1117-1119.

［4］杭志喜.植物纤维原料纤维素酶水解的研究［J］.化学世界，2004（7）：369-371.

［5］ALEXANDER V G，TATYANA N，et al.Design of Highly Efficient Cellulase Mixtures for Enzymatic Hydrolysis of Cellulose［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97（5）：1028-1032.

［6］MICHAEL J S，KNOSHAUG E P，ADNEY W S，et al. Synergistic enhancement of cellobiohydrolase performance on pretreated corn stover by addition of xylanase and esterase activities［J］.Bioresource Technology，2007：1-4.

［7］OGRENK，BURAR，SADDLERJ，etal.Effectof hemicellulose and lignin emoval on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover［J］.Bioresource Technology，2007，98：2503 -2510.

［8］MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Analyt Chem，1959，31：426-428.

［9］洪枫.里氏木霉合成木聚糖酶及制备功能性木低聚糖的研究［D］.南京林业大学博士学位论文，1997.

［10］GHOSE T K.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and App Chem，1987，59（2）：257-268.

［11］于兆海.里氏木霉纤维素酶的分离纯化与酶学性质研究［D］.南京林业大学硕士学位论文，2006.

［12］HAYN M，STEINER W.Basic research and pilot studies on the enzymatic conversion of lignocellulosics In Bioconversion of Forest and Agricultural Plant Residues［M］.Singapore Printed，1993：39-41.

Effect of addition of xylanases on the enzymatic hydrolysis of corncob

XING Ling，JIANG Hua*
（College of Chemical Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）

The effect of supplementation of xylanases from Trichoderma viride was investigated on the conversion of the corncob pretreated by diluted sulfuric acid.lt was shown that addition of xylanases increased the initial conversion rate of corncob into glucose and xylose，but the enhancement was insignificant after 24h.lt was demonstrated that conjugated action of cellulases and xylanases resulted in a higher final sugar production as compared to cellulases alone based on per gram of protein.lt was shown that the optimal loading of xylanses was 60lU/g（O D substrate）when cellulase loading from 5 to 35FPU/g was used during the hydrolysis of the pretreated corncob.The yields of glucose and xylose at 72h using the 35FPU/g cellulases were almost equal to those using a mixture of 15FPU/g cellulases and 60lU/g xylanases.Therefore，addition of xylanase would provide an opportunity to decrease cellulase and protein loading at the same hydrolysis extent.

xylanases；cellulases；corncob；enhancement

TS210.1

A

1002-0306（2010）11-0228-04

2009-10-13 *通讯联系人

邢玲（1983-），女，硕士研究生，主要从事生化分离的研究。