屈艳南，侯玉泽，邓瑞广，张改平，*，刘庆堂，职爱民，刘宣兵，李彬彬，柴书军

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003；2.河南省农业科学院动物开放式免疫学重点实验室，河南郑州450002）

磺胺喹恶啉人工抗原合成及鉴定

屈艳南1，2，侯玉泽1，邓瑞广2，张改平2，*，刘庆堂2，职爱民2，刘宣兵1，2，李彬彬1，2，柴书军2

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003；2.河南省农业科学院动物开放式免疫学重点实验室，河南郑州450002）

国内首次用重氮化法将磺胺喹恶啉（SQ）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联，制备免疫抗原SQ-BSA和包被抗原SQ-OVA。紫外扫描法与SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定表明偶联成功，偶联比分别为10.1∶1、9.8∶1。将SQ-BSA免疫BALB/C小鼠，获得了高效价、敏感性好的抗SQ血清，表明ELISA方法鉴定偶联成功，为进一步制备抗SQ单抗奠定了基础。

磺胺喹恶啉，人工抗原，鉴定

磺胺喹恶啉（SQ）又名磺胺喹沙啉，是一种高效抗虫剂、抗菌药，口服后吸收迅速，对禽类疾病有很好的疗效，应用广泛，但有一定毒性，且易在动物的可食性组织中残留［1］。由于SQ的良好药效，养殖场在饲养动物过程中向饲料或动物饮用水中添加SQ，又未完全遵守国家兽药典规定的投药量、投药期和休药期的规定，导致SQ在动物源食品中大量残留。人食用这些动物源食品后，可能发生变态、过敏等反应，严重的还会产生致畸、致癌作用。因此世界各国均制定了相对严格的兽药残留标准，我国及欧盟、日本、美国等西方发达国家制定其残留标准为100ng/g［2］。SQ结构如图1所示。关于SQ的残留分析，国内外报道较多，主要是高效液相色谱法（HPLC）［3，6］、微生物学方法（SST）［4］，液相色谱-质谱联用分析法（LC-MS）［5］。HPLC与LC-MS方法通常需要多个液—液分配（LLE）和浓缩步骤，操作复杂，仪器设备要求高，不便于养殖场用于大规模筛查自检，且直接针对SQ的分析较少［7］；SST又难以实现超微水平检测。试纸条检测是一种具有特异、敏感、快速、简便，直观等优点的新型检测手段。本研究旨在合成SQ人工抗原，为制备SQ单抗及开发SQ残留检测试纸条奠定基础。

图1 SQ结构式

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

磺胺喹恶啉（SQ）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA） 美国Sigma公司；实验用水为重蒸去离子水（DDW） 实验室自制；氢氧化钠等其它试剂

国内市售分析纯级；实验动物 SPF级6周龄雌性Balb/C小鼠，购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南省动物免疫学开放式重点实验室饲养。

U-3000紫外扫描仪（UV） 日本岛津；DU-600蛋白核酸分析仪 Beckman公司；3K-18高速冷冻离心机 德国 SIGMA公司；550型酶标仪 美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统、HI9321酸度计 美国HANNA公司；超净工作台 美国Forma Scientific公司；AE260电子天平 德国METTLER公司；DK-8D电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；JM-250电泳仪 大连捷迈科贸有限公司；2-93自动双重纯水蒸馏器、93-3定时恒温双向磁力搅拌器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 SQ人工抗原的制备 SQ为小分子物质（MW =300.4），本身并不具有免疫原性，需要将其偶联到大分子载体蛋白上形成人工完全抗原才能免疫动物。根据SQ的分子结构与性质，采用重氮化反应［8］将它与载体蛋白偶联。

免疫抗原（SQ-BSA）制备：称取 SQ4.0mg，加0.8mL HCl（1mol/L），0～4℃冰浴避光搅拌反应5min，逐滴加入单蒸水溶解的NaOH溶液，KI试纸刚刚变蓝时停止加入。搅拌反应5min，加BSA 8mg，调pH至9，0～4℃冰浴搅拌反应过夜，PBS缓冲液透析7d。偶联反应路线见图2。

图2 SQ偶联反应式

包被抗原（SQ-OVA）的制备：OVA取6.7mg，具体方法及化学物质用量同上。

1.2.2 人工抗原的鉴定

1.2.2.1 紫外扫描鉴定及偶联比估算 人工抗原的紫外扫描鉴定：将人工抗原用PBS稀释到适当倍数后，测定280nm和260nm的OD值，按下式计算蛋白的浓度即抗原的浓度［9］：

蛋白浓度（mg/mL）=1.45OD280-0.74OD260

据此用PBS缓冲液配制SQ和BSA标准溶液，调节SQ与BSA标准溶液浓度与SQ-BSA溶液中蛋白质的浓度一致，在波长220～420nm范围内进行紫外扫描，根据扫描图谱进行人工抗原鉴定。偶联比的估算：将SQ、BSA及SQ-BSA人工抗原配制成一定浓度的溶液，使SQ、BSA溶液浓度与SQ-BSA浓度相同（方法同上），对它们分别进行紫外扫描，得到OD值ASQm、ABSAm（分别为SQ在SQ和BSA最大吸收波长处的OD值）和BSQm、BBSAm（分别为BSA在SQ和BSA最大吸收波长处的OD值）；根据算式：K=OD值/CL（K为克分子消光系数；C为各物质浓度；L为光径），分别计算出 KASQm、KABSAm、KBSQm、KBBSAm，分别为 SQ、BSA的两个摩尔消光系数。

定点检测SQ在SQ和BSA的最大吸收波长处的OD值即：ACSQm、ACBSAm。

按下式计算SQ与BSA在SQ-BSA人工抗原中的克分子浓度比，即偶联比［9］：

CSQ/CBSA=ACSQm·KBBSAm-ACBSAm·KBSQ/ACBSAm·KASQm-ACSQm·KABSAm

计算SQ与OVA在SQ-OVA中的偶联比，方法同上。

1.2.2.2 SDS-PAG凝胶电泳鉴定 配制各种电泳溶液，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度10%［10］，浓缩胶电压120V，分离胶电压60V，上样量为20μL，考马斯亮蓝染色3～4h，置脱色液中脱色过夜。

1.2.2.3 动物免疫鉴定 用SQ-BSA疫6周龄雌性BALB/C小鼠5只，免疫剂量50μg/只，0.2mL/只，背部皮下分4～6点注射。首免，用无菌 PBS溶解SQ-BSA，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解SQ-BSA，与等量FIA混合，充分乳化，共免4次，每次间隔3周，最后1次免疫后10d断尾采血分离血清，ELISA方法检测抗SQ多克隆抗体（pAb）效价及敏感性。

pAb效价测定：采用间接ELISA测定pAb效价。SQ-OVA包被，包被浓度1μg/mL，包被量100μL/孔，37℃温育2h，PBST洗板4次，每次间隔3min（下同）；用5%猪血清封闭200μL/孔，37℃温育1h，洗板；加多抗血清（pAb），50μL/孔，用封闭液倍比稀释，设阴性对照（NC）和空白对照（BC），37℃温育15min，洗板；加RaMIgG-HRP，1∶1000用封闭液稀释，50μL/孔，37℃温育25min，洗板；加酶底物TMB显色100μL/孔，RT10min；终止反应，100μL/孔2mol/L H2SO4，读OD450nm值；结果判断，以待测孔OD450nm值≥NC OD450nm值的2.1倍（P/N≥2.1），判为阳性［11］。

敏感性鉴定：采用阻断ELISA鉴定其敏感性。SQ-OVA包被，包被浓度1μg/mL，包被量100μL/孔，37℃温育2h，PBST洗板4次，每次间隔3min（下同）；5%猪血清封闭，200μL/孔，37℃温育1h，洗板；加OD450nm为1.0的小鼠血清50μL和不同浓度的SQ标准品作抑制剂，设NC和BC，37℃温育15min，洗板；加RaMIgG-HRP，1∶1000用封闭液稀释，每孔50μL，37℃温育25min，洗板；加酶底物TMB显色，每孔100μL，室温反应10min；终止显色反应，每孔加入终止液2mol/L H2SO4100μL，用酶标仪读OD450nm值；计算抑制率（B/B0，B0为SQ0浓度的标准品吸光值，B为其他SQ不同浓度的标准品吸光值）［12］。以B/ B0为纵坐标，以SQ浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标轴上绘制SQ对SQ pAb的抑制曲线，根据曲线趋势推导回归方程，计算SQ pAb对SQ的50%抑制浓度（50%Inhibitive concentration，IC50），以IC50衡量其敏感度。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的鉴定结果

2.1.1 UV鉴定结果 如图3。由图可见，SQ-BSA曲线与BSA曲线形状差异较大，280nm处的BSA特征吸收峰与253nm处SQ特征吸收峰叠加并位移至261nm处，在253nm SQ特征吸收峰处SQ-BSA吸收峰明显上升，表明人工抗原偶联成功［13］。

表1 间接ELISA测小鼠抗SQ血清效价

表2 小鼠抗血清对SQ的抑制效价

图3 BSA、SQ和SQ-BSA的紫外扫描光谱

因此确定SQ已与两种载体蛋白都偶联成功。根据公式可以算得 SQ-BSA的偶联比为10.1∶1，SQ-OVA偶联比为9.8∶1。

2.1.2 SDS-PAGE鉴定结果 如图4。由图可见，BSA的泳动速度大于SQ-BSA，说明SQ-BSA的分子量大于BSA，证明SQ与BSA已成功偶联［14-15］。

图4 SQ-BSA偶联物的SDS-PAGE鉴定

2.1.3 pAb鉴定结果

2.1.3.1 间接ELISA效价测定结果 结果见表1。由表可知，免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到了10-3，说明获得了较好的免疫效果，其中2号小鼠效价最高为1∶6.4×103。

2.1.3.2 SQ pAb敏感性鉴定 结果见表2。SQ在10000～156.25μg/mL范围内，3只小鼠均产生了抑制，其中3号小鼠抑制效果最好，将其OD450nm值转化为B/B0，再对Lg［SQ/100］进行回归分析，3号小鼠的线性回归方程为 y=-0.2319x+1.0346，R2为0.9795，IC50为201.9761ng/mL，见图5。

3 讨论

SQ存在活性基团伯氨基，以Landsteiner创立的小分子半抗原与大分子载体交联合成完全抗原理论［16］为基础，对于带有氨基的半抗原与载体蛋白的偶联一般采用重氮化法和戊二醛（GA）法，本研究对这两种方法进行了比较，结果表明重氮化法优于GA法，进一步证实了重氮化法适用于芳香胺而GA法适合于脂肪胺的报道［17］。影响人工抗原免疫原性的因素有多种，主要因素包括载体蛋白的性质、半抗原的分子空间结构、间隔臂的长度和分子结合比。本研究选用理化性质稳定，不易变性，价廉易得的BSA作载体蛋白，BSA分子内含自由氨基多，在较大pH范围和不同离子强度下均能保持较大的溶解度，更有利于偶联反应的进行。间隔臂的介入长度要合适，过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别，不产生特异性抗体，本研究以-N=N-作间隔臂，长度适宜，有助于半抗原结构的暴露，有利于特异性抗体的产生，不会形成新的抗原表位［18］，避免了“桥抗体”的出现，又产生了针对SQ的特异性抗体。

本研究成功合成了SQ人工抗原，免疫BALB/C小鼠制备出高价、特异的pAb，为抗SQ单克隆抗体（mAb）的进一步研制及其免疫学分析方法的建立奠定了基础。

图5 SQ pAb对SQ的阻断ELISA抑制曲线

［1］胡功政，李涛.磺胺喹恶啉在肉鸡体内的代谢动力学［J］.河南农业大学学报，1988（2）：12.

［2］于维军.畜禽产品国际贸易对动物保健品的要求［J］.中尉动物保健，2004，1（2）：35-38.

［3］Perez N，Gutierrez R，Noa M et al.Liquid chromatographic determination of multiple sulfonamides，nitrofurans，and chloramph -enicol residues in pasteurized milk［J］.Journal of AOAC International，2002，85（1）：20-24.

［4］袁宗辉，伍金娥，王玉莲，等.猪肌肉和肾组织中磺胺类残留微生物学快速筛选方法及试剂盒研究［Z］.中国化工信息中心，编号：CG2006021362.

［5］张海琪，宋琍琍，徐晓林，等.液相色谱-串联质谱法同时测定大黄鱼中 20种磺胺类药物残留［J］.分析化学（FENXIHUAXUE）研究简报，2007，25（2）：268-272.

［6］查玉兵，陈美，王晓芳.高效液相色谱法测定猪肉中五种磺胺类药物残留量［J］.分析仪器，2008（4）：42-45.

［7］张盅，兰耀志.鸡肉中磺胺喹恶啉残留的测定［J］.当代畜牧，2003（5）：38-39，42.

［8］王积涛，张宝申，等.有机化学［M］.第二版.天津：南开大学出版社，2006：490.

［9］杨利国，胡少昶，魏平华.酶免疫检测技术［M］.南京：南京大学出版社，1998：273，279-280.

［10］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.北京：科学出版社，2001：456-460.

［11］Tijssen P.Practice and theory of enzyme immunoassay［M］. Amsterdam：Elsevier，1985：173-210.

［12］覃雅丽，石德时，王桂枝，等.抗氯霉素单克隆抗体的制备与鉴定［J］.中国兽医学报，2001，21（6）：11.

［13］陈新建.免疫学技术在植物科学中的应用［M］.北京：中国农业大学出版社，1998：56-58.

［14］北京大学生物系生物化学教研室.生物化学指导［M］.北京：高等教育出版社，1979：75.

［15］张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术［M］.北京：高等教育出版社，1981：60.

［16］Landsteiner K.The specificity of SEROLOGICAL reactions［M］.Boston：Harvard University Press，1945：256-259.

［17］李临生.戊二醛与蛋白质反应的特点［J］.中国皮革，1997，26（5）：12-14.

［18］刘庆堂，职爱民，张改平，等.磺胺二甲基嘧啶人工抗原的合成及鉴定［J］.河南农业科学，2008（2）：94.

Synthesis and identification of sulfaquinoxaline antificial antigen

QU Yan-nan1，2，HOU Yu-ze1，DENG Rui-guang2，ZHANG Gai-ping2，*，LIU Qing-tang2，ZHI Ai-min2，LIU Xuan-bing1，2，LI Bin-bin1，2，CAI Shu-jun2
（1.Henan University of Scienceand Technology，Luoyang 471003，China；2.Henan Key Laboratory for Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China）

The diazotization was adopted to link SQ to the carrier proteins BSA and OVA to prepare the immunogen SQ-BSA and test coating antigen SQ-OVA.Also，SQ-BSA and SQ-OVA were confirmed by ultraviolet scanning and SDS-PAGE.The conjugationratio of SQ-BSA and SQ-OVA were 10.1∶1 and 9.8∶1，respectively.The polyclonal antibody with high titre and sensitivity were also gained by immunizing the BALB/C mice with SQ-BSA.These results indicated that the hapten SQ was successfully linked to the carrier proteins，which also lay the foundation for further gain monoclonal anti-SQ.

sulfaquinoxaline；artificial antigen；identification

Q939.91

A

1002-0306（2010）11-0178-04

2009-08-17 *通讯联系人

屈艳南（1983-），女，在读硕士研究生，研究方向：食品药残快速检测。

“十一五”国家科技支撑计划（2006BAK02A21）。