王利华 周 平 周 鹏 何 炜 李兴华

肝脏原发性恶性肿瘤是最常见的恶性肿瘤之一,兔肝VX 2肿瘤模型是目前较成熟的应用于肝癌临床前期实验的大型动物模型,在肝癌影像诊断学、抗癌药物药代动力学、肿瘤化疗方法及介入治疗学等领域发挥着重要作用[1,2]。超声造影技术是近年来才发展起来的影像技术,被誉为超声医学的第三次革命,可较好地应用于肿瘤的血供评估[3,4]。本实验旨在应用超声造影技术来检测不同阶段兔肝VX 2肿瘤的血供情况,以评估超声造影在兔肝VX2肿瘤模型演变评估中的价值。

方 法

1.动物模型制作

新西兰大白兔30只,体重2.0～2.5kg,平均2.28kg,雌雄不限,购自中南大学湘雅医学院动物学部。肝肿瘤模型制备过程如下:在无菌条件下手术剥离荷瘤兔肝VX 2实体瘤块,生理盐水冲洗,去除结缔组织,选取肿瘤边缘生长旺盛的鱼肉样组织,制成大小约1.0mm×1.0mm×1.0mm的瘤块备用。兔术前禁食、禁水8h,3%戊巴比妥钠(剂量30mg/kg)耳缘静脉麻醉后固定在兔台上,青霉素40万U静脉推注预防感染,备皮后常规消毒铺巾。于兔上腹部剑突下作一正中纵行切口,长3.0cm左右,逐层进入腹腔暴露肝脏后,将兔肝左叶牵出体外,用眼科镊夹取一肿瘤组织块,将瘤块植入肝实质较厚处,然后将明胶海绵1～2块(每块大小约1.0mm×1.0mm×1.0mm)填塞并紧贴在肝表面伤口处。确认无活动性出血后将肝脏放回腹腔,后逐层关腹。兔术后均给予青霉素40万U肌注,待苏醒后送回兔笼观察。后每天给予青霉素8万U肌注。

2.实验动物分组及指标观察

图1 兔肝VX 2肿瘤超声造影动脉相表现。A.为整体增强。B.为不均匀性增强。C.为周边环状增强。

将30只荷瘤兔随机分成3组,每组10只,术后16天对第1组、术后28天对第2组、术后42天第3组荷瘤兔进行超声检查,每次检查仪器设置条件一致。先用二维超声扫查肝脏及肿瘤,选取肿瘤最大切面进入超声造影模式,采用低机械指数状态(M I≤0.12),调节合适参数(深度、聚焦、总增益、TGC等)并保持不变,经耳缘静脉团注0.1ml/kg SF6微泡悬浮液(按说明书配制)每次注射后立即尾随注入1ml生理盐水冲管,注射造影剂同时启动超声仪内置计时器,实时不间断观察病灶的灌注及回声强度变化,所有影像均存储于主机硬盘内。脱机处理图片,于动脉相测量肿瘤的最大直径,测量水平及垂直两个方向上的直径a、b,得最大直径(a+b)/2。并由两名CEUS临床诊断经验丰富的高年资医师分析造影剂灌注情况。

超声造影后立即常规处死荷瘤兔,取肝脏肿瘤组织及周围正常肝组织标本,选取肿瘤最大剖面测量最大直径,方法同上,再行大体及显微组织病理检查。

3.统计学分析

使用SPSS 16.0统计软件包进行数据分析,超声造影动脉相与大体标本测量肿瘤最大直径的两组数据进行配对t检验;超声造影动脉相测得的三组肿瘤最大直径以x±s差表示,进行q检验;计数资料进行R×C表资料的Chi-square检验,P＜0.05认为有统计学意义。

结 果

1.兔肝VX 2肿瘤模型的超声造影检查

超声造影动脉相与大体标本测量肿瘤最大直径的两组数据比较,差异无统计学意义(P＞0.10)。超声造影动脉相测得三组兔肝VX 2肿瘤最大直径:第1组(术后 16天):1.37±0.05cm,第2组 (术后 28天):2.02±0.09cm,第 3组(术后42天):2.39±0.12cm。三组数据比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。30只荷瘤兔VX 2肿瘤超声造影强化方式均呈 “快进快出”型,即在动脉相迅速增强,门脉相迅速廓清,低于周围正常肝实质,类似于一般恶性肿瘤最常见的超声造影表现。VX 2肿瘤在动脉相呈现三种增强模式(图1):整体增强、不均匀性增强、周边环状增强,三组兔肝VX 2肿瘤在动脉相增强模式上存在差异 (P＜0.05)(表1)。其中第1组主要表现为整体增强(6/10),第2组主要表现为不均匀性增强(6/10),而第3组主要表现为周边环状增强(9/10)。

2.组织病理学检查

2.1大体观察(图2):肿瘤呈类圆形,质地较硬,无明显包膜形成,切面呈灰白色鱼肉状。本实验6个动脉相表现为整体增强的VX 2瘤结节,病理结果显示结节质地较均匀,瘤内无明显坏死灶;10个动脉相表现为瘤内不均匀性增强的VX 2瘤结节,病理结果显示瘤内可见散在乳糜样坏死灶;14个动脉相表现为瘤周环状增强VX 2瘤结节,病理结果显示瘤结节中心形成单个囊腔坏死灶,腔内为浑浊液体,部分为血性液体。

2.2H-E染色(图3):VX 2肿瘤组织细胞在肝内呈浸润性癌巢,与肝实质无明显边界,间质分界不清,结缔组织多少不等,癌巢边缘见浸润状肝索结构;细胞呈不规则排列,瘤细胞体积大,形态不规则,胞质丰富,淡红染色,核肥大,其大小及形态各异,染色浓淡不均,核分裂像多见,间质内可见淋巴细胞、浆细胞浸润。坏死组织呈大片红染,其内正常细胞结构消失。

表1 兔肝VX 2肿瘤模型超声造影动脉相的增强模式(例)

讨 论

VX 2细胞株起源于Shope病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞癌,经过72次移植传代后建立了细胞株VX 2,它可接种于兔的肝脏、肾脏、肌肉等组织器官内制成原位肿瘤动物模型[5,6]。兔肝VX 2肿瘤模型一般可分为三个生长时期[7]:①实质期(种植后2～3周):大量肿瘤血管生成,在VX 2瘤周边形成大量粗细不均、杂乱的供瘤血管,并有穿支血管伸入肿瘤内部;②坏死期(4～5周):肿瘤血管生成趋于稳定,瘤体生长快于血管生成,肿瘤中央因缺血而出现坏死;③囊变期(6～7周):肿瘤血管退化,瘤中央大片液化形成囊腔。由于兔肝VX 2肿瘤血供特点及生长特性类似人类肝细胞肝癌,常被用于肝肿瘤影像诊断学、抗癌药物药代动力学、化疗及介入治疗学等方面的基础研究。

超声造影为血池造影,采用可进入组织微循环的造影剂和低机械指数连续成像方法,能够实时动态地观测实质组织的微血管结构,反映病变组织的血流灌注情况。本实验兔肝VX 2肿瘤超声造影呈现“快进快出”型强化方式。可能是因为:兔肝VX 2肿瘤的血供主要来自肝动脉[8],供养VX 2肿瘤的肝动脉血管内造影剂较静脉内的造影剂少,经过一次微循环而先到达肿瘤组织,因此形成肿瘤血管动脉相迅速增强的影像。肝实质主要由门静脉供血,在门静脉灌注后肝实质开始明显增强,而瘤体内因缺乏门静脉滋养并且肿瘤新生血管发育多不成熟,由肝动脉来的造影剂可以通过“短路”途径快速廓清而显示负性低增强区,呈现“快出”现象,从而使肿瘤与正常肝实质形成明显回声“缺失”的影像反差,即呈现“快进快出”型强化方式。

兔肝VX 2肿瘤在二维超声上呈等回声、低回声或稍高回声,其中以等回声多见,与周围正常肝实质灰阶对比不明显,肿瘤边界显示欠清晰,故在测量上会有较大误差。本组采用超声造影对30个兔肝VX 2肿瘤进行了测量,发现测量结果与病理结果相似,与文献报道一致[9,10]。说明超声造影在兔肝VX 2肿瘤测量方面有明显的优势,这主要是因为在动脉相造影剂迅速充填肿瘤血管,呈“灯泡征”,肿瘤与周围肝组织灰阶对比明显增强,从而可清晰显示肿瘤及其边界,有利于准确进行测量。本组采用超声造影还对不同阶段组的兔肝VX 2肿瘤进行测量,结果发现第3组大于第2组,第2组大于第1组(P＜0.05),说明随着时间的推移,兔肝VX 2肿瘤呈逐渐增大趋势。

本实验研究发现30个兔肝VX 2肿瘤,有6个VX 2瘤结节表现为动脉相整体增强,病理结果显示瘤内无明显坏死灶;24个VX 2瘤结节表现为动脉相瘤内不均匀性增强或周边环状增强,与病理结果显示的坏死范围一致,说明我们可以根据肿瘤在动脉相的增强模式来准确判断肿瘤的血供状态及坏死范围。

本实验对处于不同生长阶段的兔肝VX 2肿瘤在动脉相增强模式进行了研究,发现:实质期(第1组)主要呈整体增强(6/10),坏死期(第2组)主要呈不均匀性增强(6/10),囊变期(第3组)主要呈周边环形增强(9/10)。可能的原因:兔肝VX 2肿瘤早期肿瘤细胞即开始释放各种血管新生因子,肿瘤新血管开始生成,逐渐形成以动脉为基础的肿瘤滋养血管网,随着肿瘤的增长,瘤周及瘤内血流逐渐丰富。当肿瘤直径超过2mm时,毛细血管大量形成,血管增多、增粗,大约在2～3周(实质期)瘤灶新生血管生长最旺盛,故此期的兔VX 2肝肿瘤在动脉相主要表现为整体增强。此后由于瘤体增长快于血管增生,瘤中心部因缺血而形成坏死灶,VX 2瘤进入坏死期(4～5周),此时动脉相主要呈不均匀增强(坏死灶无增强,肿瘤组织迅速增强)。6～7周(囊变期)瘤体血管增生明显减缓,血管退化,瘤体因缺乏血供而大部分坏死,呈大片液化坏死灶并形成囊腔,仅存瘤周少量环状血管。故此时动脉相主要表现为周边环状增强,本实验中第1组有4只荷瘤兔肿瘤超声造影表现为不均匀性增强或周边环状增强,说明瘤内出现了坏死灶,提前进入了坏死期;第2组有4只荷瘤兔肿瘤超声造影表现为周边环状增强。说明坏死范围较大,提前进入了囊变期;而第3组有1只荷瘤兔瘤灶呈不均性增强,说明瘤灶生长缓慢,尚处于坏死期。这可能是由于荷瘤兔存在个体差异的缘故。

综上所述,超声造影可准确测量出兔肝VX 2肿瘤直径及变化趋势,即随着时间的推移,肿瘤呈逐渐增大的趋势;可根据肿瘤在动脉相的增强模式来准确判断肿瘤的血供状态及坏死范围。超声造影能较好地评估兔肝VX 2肿瘤的演变过程,为兔肝VX 2肿瘤模型实验研究提供依据。