李树平 冯晓源 梁春敏 何慧瑾 孟庆刚 占昌友李 瑾顾 炳佘振珏邱龙华杨 波陈路平

二十多年前,已经有很多学者以白蛋白作为载体共价连接DTPA再与钆螯合合成一种大分子造影剂,但这些研究多集中在其作为血池性造影剂及评价血管生成的性能上[1-6];白蛋白作为一种可以被多功能修饰的前体造影剂的特性尚未被充分开发[7]。随着分子影像学的飞速发展,磁共振的高空间分辨率给阿尔茨海默病的显示带来了希望[8],同时也给磁共振的灵敏度带来了挑战。提高磁共振成像灵敏度给磁共振造影剂性能提出了更高的要求,同时制备出可以进行多功能修饰的磁共振造影剂前体也是分子影像学发展的需要[9]。本文改进了BSA-(Gd-DTPA)n的制备及纯化方法,制备出既具备高弛豫特性又还存有多个可被修饰氨基的前体造影剂,并对其体内及体外特性进行初步表征。

方 法

1.仪器与试剂

1.1仪器:EXCITEⅡ1.5T超导型磁共振扫描仪(美国GE公司);NM I20-Analyst/PQ 001(上海纽迈电子科技有限公司)。AKTA exp lorer 100中压层析系统(瑞典安发玛西亚公司);P-4010电感耦合等离子体发射光谱仪。ALPHA 1-2冻干机。显微镜、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、脱色摇床、电磁恒温磁力搅拌器等。

1.2试剂:牛血清白蛋白 (BSA,电泳纯98%,SIGM A);二乙烯三胺五乙酸环酐(DTPACA,分析纯,SIGMA);GdCl3.6H 2O(分析纯,SIGMA);Sephadex G-15葡聚糖凝胶(瑞典AB公司)。其余试剂均为国产分析纯。

2.实验动物

磁共振成像实验选取60日龄SPF级SD大鼠2只,体重约250g。急性毒性实验所用小鼠为昆明小白鼠,约 18～ 20g,共18只。

3.BSA-(Gd-DTPA)n及Gd-DTPA的制备、鉴定及表征

3.1BSA-(Gd-DTPA)n及Gd-DTPA的制备及纯化:根据文献方法[2]并加以改进,称取50mg的BSA,加入1ml的0.05m ol/L,pH=9的磷酸缓冲液(PBS),56mg的DTPACA直接加入BSA溶液中,用5mol/L的NaOH调节pH值,使pH值保持在6～7,25℃搅拌1h后,再加入与DTPACA等物质量的GdCl3溶液(用少量1mol/L的盐酸溶液溶解),继续搅拌1h。反应液用5mol/L的NaOH调节pH值至pH=7.4,使未反应的游离Gd3+沉淀,离心后除去沉淀,上清用Sephadex G-15凝胶柱进行分离,用pH=7.4的PBS作为流动相进行洗脱,在280nm处紫外监测洗脱过程,收集第一个峰的洗脱液,即为BSA-(Gd-DTPA)n偶联物的PBS溶液,冻干后再以纯水作为流动相进行脱盐分离即得纯化的BSA-(Gd-DTPA)n偶联物。

3.2BSA与Gd-DTPA偶联率的测定:采用高频电感等离子体发射光谱法 (ICP-AES)测量样品中Gd3+的含量,并计算Gd-DTPA对蛋白质的偶联率。

3.3BSA-(Gd-DTPA)n与BSA的电泳图:采用SDS-PAGE鉴定BSA-(Gd-DTPA)n的分子量范围,方法如下[10]:依次配制含聚丙烯酸胺7%的分离胶和5%的浓缩胶,样品干粉溶于PBS,待浓缩胶干后上样BSA、BSA(Gd-DTPA)n和marker各 10μg,分离胶电泳以25mA恒流,浓缩胶电泳以45mA恒流,电泳完立即置于固定液 (500ml乙醇,100ml冰醋酸,400ml蒸馏水)中50m in,考马斯亮蓝染色10min(0.29g考马斯亮蓝溶解在250ml脱色液中,在使用前边搅拌边加热至60℃,多次变换脱色液(250ml乙醇,80ml冰醋酸,加蒸馏水至1L),直至凝胶背景脱净为止。

4.BSA-(Gd-DTPA)n的弛豫性能

4.1BSA-(Gd-DTPA)n溶液的磁共振成像:取一定量BSA-(Gd-DTPA)n配成浓度为0.1mmo l/L的水溶液2ml,再分别稀释10倍、100倍、1000倍,装入2mlEP管中,对照为0.5m ol/L商品造影剂钆喷酸葡胺溶液稀释500倍(即浓度为1mmol/L),再分别稀释 10倍、100倍、1000倍、10000倍,装入 2mlEP管中行磁共振T 1W和T 2W成像,成像参数略。

4.2体外弛豫时间T 1的测定及R1的计算:准确称取一定量BSA-(Gd-DTPA)n溶于1.5ml体积分数为20%的重水中,配制成5mmol/L的溶液。用微量移液器取0.5ml置于15mm核磁样品管中,于0.5T NM I20-Analyst和PQ 001核磁共振仪(配置15mm直径探头线圈,32℃)上采用反转恢复法测其纵向弛豫时间T1,采样方式采用脚本采样;采用CPMG序列测量其横向弛豫 T 2,根据公式计算其 R1及R2值。用同样方法测定配合物在0.725mmol/L牛血清白蛋白(BSA)溶液中的弛豫时间T 1、T 2及R1、R 2值。

5.小鼠急性毒性试验

配合物BSA-(Gd-DTPA)n以灭菌注射用水配制成水溶液,溶液pH值调至7～8,以0.45μm微孔滤膜滤除不溶机械杂质,注人数只安瓶瓶中分装,熔融封管,然后于39.23×104Pa,120°C下消毒 30m in,溶液均澄清透明,表明其热稳定性良好。无菌条件下取昆明种小白鼠,从小白鼠尾静脉一次注射不同剂量(0.05ml,0.10ml,0.15ml,0.20ml,0.25ml)的样品后于当时和周后观察其急性毒性,每个剂量均平行试验3次。0.25ml剂量组及对照组3只小鼠,处死解剖后取肝、肾组织行H-E染色。

6.BSA-(Gd-DTPA)26大鼠磁共振增强扫描

EXCITE Ⅱ1.5T超导型磁共振扫描仪 (美国GE公司),人腕关节线圈。FSPGR/T 1W I序列,TR 170m s,TE1.5ms。FOV=60mm,层厚/层间距=3.0/0.5mm,数据采集矩阵为128×128。实验选用10%水合氯醛,作为大鼠的麻醉剂,腹腔注射,剂量为350～400mg/kg。造影剂的钆浓度为5mmol/L,每只大鼠约注射 1ml。

结 果

1.BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA的鉴定及表征

1.1BSA与Gd-DTPA偶联率的测定及BSA-(Gd-DTPA)26紫外扫描图:通过ICP-AES测得配合物中Gd的含量为5.1%,通过换算得出BSA与Gd-DTPA平均偶联率n=26,而白蛋白上总共有59个赖氨酸侧链氨基,据此可以推算平均每个白蛋白上尚残留23个赖氨酸侧链氨基,这些氨基可进一步进行修饰,比如连接靶向头基/荧光探针或者进行阳离子化等等。分离过程中获得的BSA-(Gd-DTPA)26在Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱上的凝胶色谱图见图1。

图1 凝胶过滤色谱法纯化BSA-(Gd-DTPA)26的色谱图,第一个较高的峰为BSA-(Gd-DTPA)26,紧接着后面的小峰为Gd-DTPA。图2 SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳图。1为BSA样品,分子量为67000左右,3为BSA-(Gd-DTPA)n样品,可见BSA-(Gd-DTPA)n有两条条带,提示分子量介于70000～118000之间,是不同n值的混合物。

1.2 BSA-(Gd-DTPA)n及BSA电泳图:SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳显示BSA-(Gd-DTPA)n的分子量,如图2。样品分子量为67000左右,BSA-(Gd-DTPA)n有两条条带,提示分子量介于70000～118000之间,是不同n值的混合物,26是不同n值的平均值。其余较淡条带为少量杂质。

2.BSA-(Gd-DTPA)26的弛豫性能

2.1 BSA-(Gd-DTPA)26溶液的磁共振成像:见图 3。

2.2 T1反演拟合曲线及R1的拟合曲线图:BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA T 1按照单组分反演拟合结果如图4,T2的反演及拟合曲线略。通过测得样品的T 1、T 2值,我们可以计算得到样品溶液的弛豫率,计算公式如下[11]:

公式(1)中,R为弛豫率,i(i=1,2)为样品的弛豫时间类型,Ti为样品的弛豫时间。另外,如果要计算溶液中溶质的浓度,我们需要知道溶液的浓度,单位为m ol/L,计算公式如下:

图3 BSA-(Gd-DTPA)26溶液及对照的 T 1WI(A)和 T 2WI(B)成像。 1、4、5列分别为钆双胺注射液,BSA-(Gd-DTPA)26水溶液、钆喷酸葡胺、BSA水溶液,浓度从上到下依次为 1、0.1、0.01、0.001、 0.0001、 0.00001mm ol/L;3为BSA-(Gd-DTPA)26水溶液,浓度从上到下 依次为 0.1、 0.01、 0.001、0.0001mm ol/L;2列为双蒸水阴性对照。

其中,To为不同浓度溶液的弛豫时间,Tw为纯水的弛豫时间,C为对应于弛豫率的样品浓度,ri为溶质的弛豫率。由以上理论,根据已测得的相应数据,可以计算出样品及对照的R1、R2、r1、r2等弛豫率。在白蛋白溶液中,我们也近似的按照该公式,计算出对应的R1、R 2、r1、r2等弛豫率。这里测得的纯水及白蛋白溶液的 T 1、T 2值分别为 3802.06/2447.08、2294.4/792.48(表 1)。

3.小鼠急性毒性试验

初步的急性毒性实验显示,各剂量组小鼠一周后均毛色光泽如初,无任何中毒症状,1周内无一死亡,其体重与对照组无区别。解剖后观察实验组小鼠的肝、肾均无明确可见的病理改变征象,与生理盐水对照组无显著性差异(图5)。

4.BSA-(Gd-DTPA)n大鼠磁共振增强扫描

图4 BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA水溶液反演及拟合曲线图。A为反演曲线,B拟合曲线。图示BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA T 1值分别为 68.45m s、37.35m s。

表1 BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA在不同溶液中的弛豫时间及弛豫率

图5 肝脏H-E染色(×40)。实验组(A)与对照组(B)未见显著差异,未见明显巨噬细胞增多。

SD大鼠体内磁共振成像实验:肝肾平扫T 1W I轴位扫描,尾静脉注射1ml BSA-(Gd-DTPA)26后分别于1m in、5m in、10m in及30m in后进行肝肾多期增强扫描。该实验初步评价了BSA-(Gd-DTPA)n对肝脏、肾脏和腹主动脉MRI信号的增强作用,并分析了其随时间的变化情况。图6、图7为静脉注射BSA-(Gd-DTPA)26大鼠肝脏和肾脏MRI信号强度随时间的变化情况。注射造影剂BSA-(G d-DTPA)26后,1min内肝脏和腹主动脉就出现了明显的增强效果,在整个成像过程中对肝脏信号增强始终保持升高的趋势,它对腹主动脉增强模式类似于长循环血池性造影剂,这是由于白蛋白的长循环特性决定的。BSA-(Gd-DTPA)n和Gd-DTPA具有非常相似的肾脏代谢模式,但与其又有所不同。注射造影剂后不久,肾脏就出现了明显的增强效果,一直到实验结束,肾盂内仍可见造影剂。可以在多个时间窗内同时看到肾盂与腹主动脉的增强。

讨 论

本研究成功制备了大分子磁共振造影剂BSA-(Gd-DTPA)n。制备过程中,pH值是影响合成结果及效率较为重要的因素。BSA与DTPA的偶联是在碱性条件下进行的,在pH=9的条件下,其偶合效率较高。由于GdCl3在中性或碱性条件下易生成Gd(OH)3沉淀,阻碍钆的螯合,因此后续螯合钆的实验应在酸性条件下进行,本实验中用5mol/L的NaOH将pH值调至6～7,且用1mol/L的盐酸溶液溶解GdCl3,获得较好的螯合效果。由于DTPACA具有两个环酐,容易使两个蛋白质交联沉淀,从而影响与钆的进一步的螯合反应,因此控制BSA与DTPACA的比例在整个反应过程中也至为关键。太低的比例,偶联的DTPA太少影响钆的螯合,从而影响造影剂的弛豫率;太高的比例,白蛋白上的赖氨酸侧链氨基反应完全,无法进行下一步的修饰。本实验采用控制BSA与DTPACA的比例为1:50,获得较为合适的偶联率。同时,实验中应避免pH值太高或太低,否则白蛋白容易变性。本实验中BSA与Gd-DTPA平均偶联率n=26,而白蛋白上总共有59个赖氨酸侧链氨基,据此可以推算平均每个白蛋白上尚残留23个赖氨酸侧链氨基,这些氨基可进一步进行修饰,比如连接靶向头基/荧光探针或者进行阳离子化等,这样BSA-(Gd-DTPA)n就可以作为靶向性磁共振造影剂的前体,进一步拓宽其应用范围;或者与装载治疗药物的纳米粒或其他载体系统连接,成为靶向病变的靶头,进而通过MRI监测药物的靶向性及体内分布。

实验中,通过0.5T NM I20-Analyst和PQ 001核磁共振仪分别测定了BSA-(Gd-DTPA)26和Gd-DTPA在32℃时的横向和纵向弛豫时间,分别得到了T 1和T 2的反演和拟合曲线,具体形象地反映了两种造影剂的弛豫特点,并且通过公式计算出两种造影剂在5mmol/L时的弛豫率。公式1/To=1/Tw+ri×C,是在忽略溶质分子相互作用的前提下得到的[12],而且一般仅适用于稀溶液,本实验中溶液的浓度较稀,可以按照该公式来计算弛豫率,预实验中,根据不同浓度造影剂R1/R2值拟合的曲线呈线性关系,综合考虑,在误差允许的范围内,利用该公式计算造影剂的弛豫率是可信的。另外考虑到造影剂进入人体后,需通过血浆的存储和运输,与单纯的纯水的环境有所不同。因此,造影剂在纯水中的弛豫率不能完全代表其在人体血液中的弛豫性能。血清白蛋白 (serum albumin)是哺乳动物体内多种内源性和外源性物质的存储、转运蛋白,也是血浆中含量最丰富的具有许多生理功能的蛋白质之一。因此本研究在测定造影剂在纯水中的弛豫率外,还测定了造影剂在牛血清白蛋白溶液中的弛豫性能,对了解此类造影剂在体内的作用过程具有重要意义。考察过程中,仍沿用上述公式计算其弛豫率,但是该公式能否适用于造影剂的白蛋白溶液尚待进一步研究。

小鼠急性毒性实验表明造影剂在诊断所需剂量下毒性较低。但是不排除来自于体内其他金属离子或小分子配体的竞争配位,从而破坏了体内的生化平衡,导致一定的毒性,在应用于临床前,应考虑将其进行适当的修饰,使其达到在体内弛豫性能和安全性能的双重保障。

大鼠磁共振增强扫描初步揭示了BSA-(Gd-DTPA)n的长循环性能,该性能有利于其多时相显示血管及分支,且有利于靶向造影剂靶向头基与病灶的充分结合。但是过长的半衰期势必会影响到非特异性背景的及时清除,给成像时机的选择带来一定的困难。后续的研究将进一步具体定量BSA-(Gd-DTPA)n的血浆半衰期,从而为造影剂前体BSA-(Gd-DTPA)n的优化提供一定的依据。

致 谢

本实验中造影剂弛豫率的测量得到上海纽迈电子科技有限公司的鼎立协助,特此致谢。