卢仁泉,胡 娟,吴兴中,郭 林＊

(1.复旦大学附属肿瘤医院检验科、复旦大学上海医学院肿瘤学系,上海200032;2.复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系)

近年来针对卵巢癌的肿瘤标志物方面的研究很多,至今CA125仍然临床上应用最广泛的卵巢癌血清标志物。但由于CA125的灵敏度仅为40%左右,而且在某些良性疾病中也会升高,大大限制它的临床应用。2003年,Hellstrom研究发现,人附睾上皮分泌蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)可应用于卵巢癌的早期诊断,其敏感度与特异性均优于CA125[1,2]。我们进行了HE4的克隆表达,希望能为进一步制备HE4诊断试剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒和菌株 人卵巢癌SKOV3细胞株由上海市肿瘤研究所惠赠。pUCm-T载体购自申能博彩公司,PET28a(+)表达载体由浙江大学动物预防医学研究所惠赠。TOP10、BL21菌株由复旦大学上海医学院生化与分子生物学实验室提供。

1.2 主要试剂及工具酶 Trizol试剂、MMLV逆转录酶购自 Introvigen公司。dNTP、10×PCR buffer、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ和 SalⅠ均为Takara生物公司产品。凝胶回收试剂盒由Genebase公司提供。质粒抽提试剂、抗His-Tag抗体购自天根生物公司。引物合成与测序由上海生工公司完成,引物序列为 P1:5′-accgggatccatgcctgcttgtcgcctagg-3′和P2:5′-acgcgtcgactcagaaattgggagtgacac-3′。其他主要试剂均为国产分析纯。

1.3 细胞培养及 RNA提取 人卵巢癌SKOV3细胞株用10%小牛血清在5%CO2、37℃条件下常规培养,待细胞数量到达5×106时,用 Trizol试剂按操作说明书抽提总RNA。

1.4 RT-PCR扩增 HE4基因 利用25μlRT体系,即 RNA 2μl、OligdT 1μl、H2O 8.5μl,5 ×RT buffer 5 μl、2.5 mMdNTP 8μl,M-MLV 0.5μl;42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min,得到 RT产物(cDNA)。50μl PCR体系:RT产物1μl,H2O 36μl,10×buffer 5μl,2.5mMdNTP 5μl,引物 P1、P2各 1μl,Taq聚合酶 1 μl。PCR反应条件为:94℃5 min;94℃30 s,60℃30 s,72℃45 s,35个循环;72℃5min。PCR产物经1%琼脂糖(Gibco公司)凝胶电泳分离与鉴定,并用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.5 HE4基因重组测序质粒的构建 将4μl PCR产物与1μl PUCm-T载体在T4连接酶的作用下,16℃循环水浴连接4-5小时。连接产物转化入感受态TOP10细菌中,涂布于含氨苄青霉素(100 mg/L)LB平板上,用 IPTG作为诱导剂,X-Gal作为生色剂,37℃16-24小时,形成蓝白斑。挑取白色菌落,接种含氨苄青霉素的LB培养液,培养过夜。取部分菌液测序,并用质粒抽提试剂提取菌液中的重组质粒,进行双酶切鉴定。

1.6 HE4基因重组表达质粒的构建 利用PET28a质粒为载体构建原核表达载体,根据PET28a质粒的多克隆位点,用限制性内切酶BamHⅠ,SalⅠ分别双酶切PUCm-T-HE4和PET28a,凝胶回收得到HE4片段和酶切后的PET28a质粒,两者同上(重组测序质粒构建的连接部分)连接后得到原核表达载体PET28a-HE4。将该PET28a-HE4质粒转化入感受态表达菌E.coliBL21中,涂布于含卡那霉素(100 mg/L)的LB平板,37℃培养16-24小时,挑取菌落,转种于含卡那霉素的LB培养液中进行培养,抽提质粒进行双酶切及测序鉴定。

1.7 HE4融合蛋白的表达及鉴定 从鉴定正确的上述LB培养液中取少量菌液,转种后待细菌生长至A600为0.6左右时,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白的表达。我们进行诱导表达条件的优化:在37℃和28℃两个温度条件下,分别加入IPTG使其终浓度为0.1,0.2,0.5和1.0 mmol/L进行目的蛋白的诱导表达,选择最佳诱导条件。在最佳诱导条件下诱导后1,2,3,4和5 h经SDS-PAGE鉴定HE4融合蛋白的表达量,确定最佳表达时间。然后收集细菌沉淀,用 PBS重悬后,经超声后取上清进行SDS-PAGE鉴定,以及利用抗His-Tag抗体进行Western blot鉴定。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增 HE4基因 用 Trizol试剂抽提出总 RNA,再以 RNA为模板,特异性扩增 HE4基因,得到大小约为400 bp的DNA片断。1%琼脂糖凝胶电泳结果,见图1。

图1 HE4基因 RT-PCR产物电泳结果

2.2 重组测序质粒克隆、测序

HE4基因的扩增产物与PUCm-T载体连接后转化入TOP10菌,LB平板上生长出白色光滑菌落。白色菌落LB液培养后,抽提其中质粒,经BamHⅠ、SalⅠ双酶切结果,如图2所示(400 bp左右处出现目的条带)。测序结果也显示重组质粒含有HE4基因。

2.3 HE4基因表达载体的构建

构建的PET28a-HE4重组表达质粒用限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,可产生400 bp左右的DNA片段(HE4基因片段),鉴定结果见图3。测序的结果也表明已连接且连接顺序也正确。

2.4 HE4基因表达及鉴定

上述的重组表达质粒PET28a-HE4转化入BL21表达菌后经 IPTG诱导,表达出了 HE4融合蛋白。最佳诱导条件确定为在28℃条件加入的IPTG终浓度应为0.5mmol/L,最佳诱导时间为5 h。诱导表达的HE4融合蛋白 SDS-PAGE和western blot鉴定结果 ,见图4。

3 讨论

Kirchhoff等[3]最先在人的附睾上皮中克隆出HE4基因,其编码精子成熟有关的蛋白酶抑制剂。该基因位于染色体20q12-13.1,全长为12 kb左右,由5个外显子和4个内含子组成,存在多种剪切方式,编码分泌小分子蛋白,均含有高度保守的WAP(Whey Acidic Protein)结构域,该结构域含有8个半胱氨酸组成的4个二硫键核心区域,与细胞外蛋白酶抑制剂有很高的同源性[4]。1999年,Schummer[5]等运用cDNA array杂交技术分析了不同来源的卵巢癌及癌旁组织中的基因表达水平,发现HE4 mRNA在卵巢癌组织中高表达,但在癌旁组织中不表达。直至2003年,Hellstrom等[1]研究发现在大多数卵巢癌患者血清中的HE4蛋白量比正常人有明显提高,证实该蛋白可作为临床诊断卵巢癌的一个新指标。

图2 重组质粒pUCm-T-HE4双酶切产物电泳结果

图3 重组表达质粒PET28a-HE4双酶切产物电泳结果

图4 HE4融合蛋白表达的SDS-PAG电泳及western blot鉴定结果

也有学者认为HE4可以与CA125联合检测来提高卵巢癌的诊断敏感性[6,7]。Moore等[7]在对几种新型卵巢癌肿瘤标志物的临床应用研究中发现,单个肿瘤标志物测定时,HE4的敏感度最高,可达72.9%,对于早期肿瘤(临床分期 I期),HE4是最好的单个标志物。而联合检测时,CA125、HE4联合测定敏感性最高。

但是,目前国内尚未见检测HE4的注册试剂盒供应,该项检测在临床上的研究也还未广泛展开。为使该指标应用于临床,得以早期发现卵巢癌,利用基因工程手段获得HE4融合蛋白作为抗原,并从而研制出HE4检测试剂盒,显得尤为重要。

本研究工作采用RT-PCR技术从SKOV3细胞株总RNA中扩增到一条400 bp左右大小的DNA片断,经克隆后测序鉴定,证实此片断为 HE4基因的序列。我们进一步将该 HE4基因与克隆载体PUCm-T进行连接,转化入感受态的TOP10菌中,含重组质粒PUCm-T-HE4的TOP10菌生长出白色光滑菌落。挑选白色菌落转种后,抽提出大量克隆的重组质粒,进行电泳鉴定以及克隆测序。测序结果表明HE4基因已成功克隆。再将该重组测序质粒和表达载体PET28a(+)均进行双酶切后连接,转化入BL21表达菌中诱导表达,后经SDS-PAGE及western blot鉴定,结果表明可表达HE4融合蛋白且为可溶性高表达。确定的最佳诱导温度为28℃,最佳诱导时间为5h左右,表达出的HE4融合蛋白,分子量在14 KD左右,而且该融合蛋白带有 His标签,大大方便了其进一步纯化。

本研究获得的HE4蛋白可用作抗原或者诊断试剂盒的标准品,为开发检测卵巢癌的诊断试剂提供了原料保证。我们将进一步纯化、免疫动物获得抗体,为卵巢癌的诊断开辟新手段奠定基础。

[1]Hellstrom I,Raycraft J,Hayden2Ledbetter M,et al.The HE4(WFDC2)protein is a biomarker for ovarian carcinoma[J].Cancer Res,2003,63(13):3695.

[2]Drapkin R,Von Horsten HH,Lin YF,et al.Human epididymis protein 4(HE4)is a secreted glycoprotein that isoverexpressed by serousand endometrioid ovarian carcinomas[J].Cancer Res,2005,65(6):2162.

[3]Kirchhoff C,Habben I,Ivell R,et al.A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors[J].Biol Reprod 1991,45:350.

[4]Clauss A,Lilja H,Lundwall A.A locuson human chromosome 20 contains several genesexpressing protease inhibitor domainswith homology to whey acidic protein[J].Biochem J,2002,368:233.

[5]SchummerM,Wallap VN,Bumgarner RE,et al.Comparative hybridization of an array of 21500 ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas[J].Gene,1999,238(1):375.

[6]Rosen DG,Wang L,Atkinson JN,etal.Potentialmarkers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol 2005,99(2):267.

[7]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al,The use ofmultiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patientswith a pelvic mass[J].Gynecol Oncol,2008,108(2):402.