王 鹏,于金明,朱玉存,程勋全,杨渭川,葛 锐,王自勇,乔飞飞

(1.合肥仁济肿瘤医院伽玛刀研究中心,安徽合肥 230022;2.山东省医学科学院山东省肿瘤防治院放疗科;3.安徽省立医院放射治疗科)

大鼠正常脑组织伽玛刀照射后MRI表现及GFAP表达的实验研究

王 鹏1,2*,于金明2,朱玉存1,程勋全3,杨渭川1,葛 锐1,王自勇1,乔飞飞1

(1.合肥仁济肿瘤医院伽玛刀研究中心,安徽合肥 230022;2.山东省医学科学院山东省肿瘤防治院放疗科;3.安徽省立医院放射治疗科)

目的研究伽玛刀(Gamma knife)照射大鼠尾状核后胶原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达随时间的变化,探讨星形胶质细胞的增殖与放射损伤的关系以及放射性损伤的影像学表现。方法40只成年雌性Wistar大鼠,10只大鼠作为对照组。30只大鼠接受MASEP-SRRS型伽玛刀8 mm准直器以50 Gy(50%等剂量线)照射大鼠右侧尾状核。照射后的30只大鼠随机分为3组,每组10只。不同组别的大鼠分别在照射后第1,4,12周深度麻醉下断头取出脑组织,行免疫组织化学染色观察GFAP的表达,并使用梯度柱法测量脑组织的比重。大鼠处死前接受1.5 T MRI轴位平扫和增强扫描。结果MRI提示照射后第12周可发现受照大鼠尾状核T2相可见受照区信号增高,增强T1相可见受照区强化明显。对照组大鼠脑组织内均匀散在分布少数GFAP阳性细胞,轮廓清楚,星形突起纤细。照射后4周靶区内GFAP阳性细胞数目开始增多,细胞形态变得不规则。至12周时GFAP阳性细胞进一步增多,胞体变大,细胞突起粗大不规则,胞浆染色呈深棕色。照射后第4周和第12周检测到照射侧脑组织比重与对侧相比显著减轻。结论GFAP可作为衡量脑放射性损伤的指标。照射后早期即出现脑水肿反应和血脑屏障破坏。在不同时间点的病理变化可以通过MRI信号观察不同时间点的病理变化。

胶质纤维酸性蛋白;中枢神经系统;放射损伤

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0023)

本研究旨在建立伽玛刀放射性损伤的大鼠动物模型,探讨正常脑组织受伽玛刀照射后在不同时间点脑组织胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及脑组织水含量变化,以及MRI影像学改变,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及主要实验仪器 成年健康雌性Wistar大鼠40只,体重300-400g。玛西普(深圳)医学科技有限公司生产MASEP-SRRS型伽玛刀,焦点吸收剂量率 1.5 Gy/min,运用MASEP Superplan 2.0剂量计划系统进行剂量计划设计。影像定位采用Siemens 1.5 Tesla超导MRI。用自制高强度有机玻璃大鼠立体定向放射外科固定装置与Leksell立体定向仪框架及适配器相配合。抗体及免疫组化试剂盒购自北京中山公司。

1.2 实验方法 将大鼠在10%水合氯醛(3 ml/Kg体重i.p)麻醉下固定于伽玛刀立体动物定位头架上,用Siemens 1.5 Tesla超导MRI行大鼠大脑横轴薄层连续扫描,所得影像资料输入计算机工作站,将治疗靶点的位置确定于大鼠(n=30只)右侧尾状核,采用8 mm准直器对大鼠脑组织实施照射,等剂量曲线50%,周边剂量50 Gy,中心剂量100 Gy。照射组(n=30只)行伽玛刀照射,并随机分为3组,每组10只,拟分别于第1周末,第4周末和第12周末处死。对照组(n=10只)未行伽玛刀照射。伽玛刀治疗后大鼠常规饲养,避光、温暖、给予充分的水和食物,观察大鼠的活动、精神状况、饮食以及体重等。大鼠在处死前使用1.5 T MRI观察影像学变化(横轴)。在第1、4、12周末的时间点分别将各组大鼠处死,在10%水合氯醛深度麻醉下,开胸经左心室升主动脉插管先以100 ml生理盐水冲洗血液,随后用冷的(4℃)含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液液灌注固定,取出脑组织,标本于10%福尔马林中固定24小时,免疫组化采用SP法,阴性对照用PBS代替一抗。

1.3 图像分析 切片经图像分析仪(Quantimet 570C,Leica)处理。GFAP阳性细胞面积测定选择对照组大鼠及照射组大鼠的照射侧和对照侧尾状核,在10(目镜倍率)×20(物镜倍率)倍率下,任选5个视野,计数GFAP阳性细胞数。

1.4 脑组织比重的测定 在大鼠双侧大脑半球尾状核各取5-10 mg脑组织,以梯度柱法测定脑组织的比重。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 各组动物在观察期间无一死亡,但摄食减少,活动稍减少,皮毛显不洁,发黄,体重减轻。

2.2 大鼠照射后MRI变化 大鼠在第1、4、12周行头颅MRI检查,在第12周再次行MRI检查可见T2WI可见受照靶区呈高信号,结构有破坏,增强TIWI可见受照靶区有强化。第1、4周末影像学未见有T2WI高信号,增强T1WI未见有强化。见图1、2。

2.3 GFAP免疫组织化学染色观察 正常对照组大鼠脑相当于靶组织内均匀散在分布少数的GFAP阳性细胞细胞轮廓清楚,星状突起纤细,为星形细胞。GFAP分布于星形细胞胞浆及星状突起中,为棕黄色颗粒。照射后4周靶区GFAP阳性细胞散在分布,轮廓清楚,星状突起纤细,形态、数目较对侧及对照组显著增加。照射后12周右侧尾壳核区域内GFAP阳性细胞数目较对侧及假照射组显著,可见神经元肿胀,增多,胞体变大,胞浆颜色较深。见图3、4,表1、2。

2.4 脑组织比重的测定 大鼠正常大脑的脑比重为1.047,照射后1周的脑比重为1.044,照射后4周的脑比重为1.036,照射后12周的脑比重为1.035。伽玛刀照射后第4周和第12周脑组织比重明显低于正常对照组和照射前水平(P＜0.05)。对侧脑组织比重的变化各组间无显著差异。

图1 第12周增强T1WI可见大鼠尾状核强与对侧形成对比

图2 第12周T2WI可见大鼠 尾状核呈高信号,高于对侧尾状核

图3 照射后4周靶区GFAP 阳性细胞散在分布,轮廓清楚,星状突起纤细形态、数目较对侧及对照组显著增加(10×20倍)

图4 照射后12周右侧尾壳核区域内GFAP阳性细胞数目较对侧及假照射组显著,可见神经元肿胀,增多,胞体变大,胞浆颜色较深(10×20倍)

表1 GFAP阳性细胞数组内比较(n=10)

表2 GFAP阳性细胞数组间比较(n=10,t检验)

3 讨论

星形细胞是哺乳动物大脑内分布最广且具有十分重要的功能,许多研究表明它与神经系统大多数疾病发生、发展有密切关系。作为细胞骨架主要成分的正常情况下,脑内GFAP少有表达,中枢神经系统受损时发生GFAP水平上调,是星形胶质细胞最常见的特征性反应,GFAP不但是星形细胞在细胞水平的特异性标记物,而且已成为病理情况下敏感的生化指标之一[1]。中枢神经系统的各种类型损伤均可引起星形细胞的反应,使星形细胞由常态转化为反应性星形细胞,表现为细胞数目增加、细胞体肥大,星形胶质细胞分支增多,并且GFAP的表达增强。因此GFAP可以作为中枢神经系统损伤范围及预后的生化标志物。

魏铭等[2]进行星形胶质细胞学伽玛刀照射的离体研究,给予胶质瘤细胞4-36 Gy伽玛刀照射后发现:原代培养胶质细胞经伽玛刀照射后GFAP表达增高,呈剂量依赖性增高,即随放射剂量的提高GFAP阳性细胞数增加更加明显,并且作者认为与缝隙连接蛋白-43(Cx-43)的异常低表达有关。

本研究选择大鼠右侧尾壳核作为照射靶点,研究的时间点选择照射后第1,4,12周,希望详细地了解照射后3个月内GFAP的动态变化,而前3个月的期限恰好是放射外科治疗并发症出现前的潜伏期,参照文献[3]的我们的实验剂量采用50 Gy,揭示了CNS在接受50 Gy照射后在第1周后没有显著变化,第4周检测时发现GFAP表达增多并且随着时间的推移星形细胞不断增多,细胞逐渐肥大,细胞突粗大不规则;照射12周后GFAP表达和细胞学形态改变进一步显著增加。这和Kamiro和杨婷等的报道是一致的。Kamiro等[4]研究伽玛刀照射大鼠脑组织后的组织学变化,他们运用4 mm准直器照射大鼠右侧顶叶皮质,给与120Gy的剂量后一天即发现GFAP染色增强,星形细胞出现肥大,在第4周时最为明显。在给予50 Gy剂量时,他们观察了1,3,6,9,12个月这几个时间点,发现在照射后一个月GFAP表达呈“±”,至三个月时呈阳性表达。杨婷等[5]同样应用4 mm准直器照射大鼠尾壳核前部,90 d后取脑组织作免疫组化研究,研究不同放射剂量照射后GFAP的表达和星形细胞的变化,发现随着放射剂量的增高反应性星形细胞的数量和GFAP的表达愈加升高。

本研究在伽玛刀照射后不同时间点对大鼠进行了MRI影像学检查。大鼠在照射后第12周行MRI检查提示有影像变化,表现为:在T2WI上表现为尾状核区不均匀高信号,T1WI相没有显著改变,增强T1WI上表现为尾状核的增强,而在第1、4周末没有提示有MRI影像学的显著改变,我们推测脑组织接受电离辐射后血管内皮细胞破坏和死亡,造成血脑屏障导致血液中的增强剂量进入瘤体,并且伴随有尾状核细胞的死亡。星形胶质细胞是组成血脑屏障的一类细胞,它伸出的足样投射几乎完全包绕着血脑屏障的毛细血管,在维持血脑屏障功能方面起着重要作用[6]。王璐等[7]作了关于GFAP表达与血脑屏障的相关性研究,发现严重烫伤后GFAP表达增加、血脑屏障的通透性增高,该作者认为脑内GFAP对维持血脑屏障功能的完整性具有重要作用,其表达水平的增加可能标志着血脑屏障的破坏,故作者推测星形细胞的反应性增生与血脑屏障损害,继发性脑水肿有关。大鼠尾状核伽玛刀照射后MRI扫描血脑屏障打开是否也存在类似机制还有待于进一步研究。

综上所述,50Gy对大鼠尾状核照射后,星形细胞增生肥大,GFAP阳性细胞增多且随着照射后时间的延长而更加明显,并且伴随者大脑比重的降低,提示GFAP可作为伽玛刀照射后放射性损伤的指标。大鼠大脑照射后组织破坏,血脑屏障打开,在1.5T MRI表现为T2WI高信号,增强T1WI有较明显的强化。

[1]Gomes FC,Paulin D,Moura-Neta V.Glial fibrillary acidic protein(GFAP):modulation bygrowth factors and its implication in astrocyte differentiation[J].Braz J Med Biol Res,1999,32(5):619.

[2]魏 铭,徐德生,张建宁,等.伽玛刀照射后胶质细胞Cx43和GFAP表达及意义[J].国际神经病学神经外科杂志,2009,36(1):1.

[3]Kamiryo T,Kassell NF,Thai QA,et al.Histological changes in the normal rat brain after gamma irradiation[J].Acts Neurochi(Wien),1996,138:451.

[4]Kamiryo T,Kassell NF,Thai QA,et al.Histological changes in the nor mal rat brain after gamma irradiation[J].Acts Neurochi(Wien),1996,138:451.

[5]杨 婷,饶志仁,吴声伶,等.γ-刀不同剂量一次单侧照射大鼠尾壳核后前脑星形胶质细胞的变化[J].中华放射医学与防护杂志,1999,19:316.

[6]Janzer RC,Raff MC.Astrocytes induce blood-brain brarrier properties in endothelial cells[J].Nature,1987,325(6101):253.

[7]王 璐,王航辉,谷秀娟.严重烫伤后脑内GFAP表达变化与血脑屏障功能的关系[J].陕西医学杂志,2009,38(1):34.

An experimental study on the expression of glial fibrillary acidic protein and MRI imaging changes in the normal Wistar rat brains after Gamma knife radiosurgery

WANGPeng,YU Jin-ming,ZHU Yu-cun,et al.(Department of Gamma Knife Center,Hefei Renji Cancer Hospital,Hefei230022,China)

ObjectiveTo explore the time-related expression of GFAP andMRI imaging changes in the normal rat brain during the subacute phase after Gamma knife irradiationy.Methods40 adult female Wistar rats were were enrolled into the study.Ten rats served as controlled group while the other thirty rats underwent Gamma knife.The right caudate-putamen nucleus was selected as the target of irradiation.A 8 mm collimator was used to transmit 50 Gy to the target region.Ratswere killed 1st,4thand 12ndweeks after gamma knife irradiation.GFAP were detected by avidin-biotin complex technique.And serial MRI imaging were obtarined at 1st,4thand 12ndweeks.And specific gravity of the brain were also obtained.ResultsThe number of GFAP positive cells(astrocytes)in the target region 1stweek after irradiation was not statistically different from that of the control group.GFAP positive cellsin the target region gradually increase in the 4thand12ndweeks after irradiation comparedwith the sham group.The shape of astrocytesbecame irregularly over time.The specific gravity decreased during the 4thand 12ndweek.High signalwere found on MRI scans by T2WI and enhanced T1WI serials.ConclusionActive astrocytosismay play an important role in the pathological changesin the normalbrain after Gamma knife radiosurgery.SerialMRI scan can observed the pathological changes by signal changes.

GFAP;Central nervous system;Radiation injury

R651.1;R814.42

A

1007-4287(2010)01-0023-04

卫生部课题(WKJ 2005-3-006)

*通讯作者

王鹏,男,博士,研究方向:肿瘤精确放射治疗、神经系统疾病的放射外科治疗以及正常组织的放射性损伤研究。

2009-04-07)