李 杨江连洲,张兆国吴 霞吴海波许 晶

(东北农业大学食品学院1,哈尔滨 150030)

(国家大豆工程中心2,哈尔滨 150030)

(东北农业大学农业工程学院3,哈尔滨 150030)

大豆水酶法提取副产物 -水溶性糖工艺优化及机理研究

李 杨1江连洲1,2张兆国3吴 霞1吴海波2许 晶1

(东北农业大学食品学院1,哈尔滨 150030)

(国家大豆工程中心2,哈尔滨 150030)

(东北农业大学农业工程学院3,哈尔滨 150030)

水酶法提油条件温和,油料蛋白的性能几乎不发生变化,无论是水相中直接加工利用,还是回收分离蛋白再利用,效果都十分理想,但有关水酶法提取植物油脂和蛋白质的副产物 -水溶性糖的相关研究较少,故针对挤压膨化后水酶法提取大豆油脂和蛋白质的副产物 -大豆水溶性糖进行研究。利用响应面分析方法对酶法提取副产物 -大豆水溶性糖得率进行了优化。建立了相应的数学模型,为以后的中试以及工业化生产提供理论基础,并且得到了最优酶解工艺条件为加酶量为 2.1%,温度为 58℃,酶解时间为 3.5 h,料水比为1:6.4,pH为 10,响应面有最优值在(20.98±1.03)%。经过验证与对比试验可知在最优酶解工艺条件下水溶性糖得率可达到 19.97%左右,比相同酶解条件下未经挤压膨化预处理水溶性糖得率以及碱提工艺水溶性糖得率均有显著提高。利用超微结构能谱分析为手段,针对水溶性糖得率提高机理进行了研究,经研究表明:①挤压膨化再粉碎后大豆细胞组织破坏,水溶性糖与蛋白复合物中蛋白质与蛋白酶作用位点较充分暴露,有利于其酶解使得水溶性糖与蛋白复合物破坏。②大豆中水溶性糖部分以糖与蛋白复合物形式存在,而想提取此类大豆水溶性糖需要将蛋白水解。

大豆水溶性糖 响应曲面 水酶法

大豆水溶性糖主要包括低聚糖 (水苏糖、棉子糖、蔗糖等)和水溶性多糖 (半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、海藻糖、木糖等)[1]。大豆水溶性糖具有多种生物活性,是一种天然的功能性成分[2],它可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性,能够用于抑制脂类氧化[3]和稳定酸性饮料中的蛋白质[4],还可以作为食品中分散剂、乳化剂、稳定剂、黏附剂[5]。因此在食品中具有广泛的应用前景。

水酶法提油条件温和,油料蛋白的性能几乎不发生变化,无论是水相中直接加工利用,还是回收分离蛋白再利用,效果都十分理想,所以水酶法提取研究逐步成为当前国内外食品工业的热点[6-12]。但有关水酶法提取植物油脂和蛋白质的副产物 -水溶性糖的相关研究较少,所以针对挤压膨化后水酶法提取大豆油脂和蛋白质的副产物 -大豆水溶性糖进行研究。应用响应曲面分析方法对酶解过程中大豆水溶性糖得率进行优化,并且利用扫描电子显微镜 -能谱连仪对水解后水溶性糖与蛋白复合物进行轰击,考察大豆水溶性糖在水解过程中与蛋白的分离机理。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

大豆:黑龙江农业科学院培植的垦农 42;Alca2 lase碱性内切蛋白酶:丹麦 novo公司。

1.2 主要仪器设备

精密电动搅拌机:江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;近红外分析仪:美国 FOSS公司;紫外可见光分光光度计:UV-2401PC,日本岛津公司;锤片式粉碎机:中国天津泰斯特仪器有限公司;扫描电子显微镜 -能谱连仪:Quanta 200;剖分式双螺杆挤压机:自制(见图1)。

图1 剖分式双螺杆挤压机

1.3 试验方法

1.3.1 大豆的成分测定

原料成分测定:利用近红外分析仪进行测定。

表1 原料大豆主要成分

1.3.2 样品含量糖量测定

采用蒽酮法测定水溶性糖含量[13]

蒽酮试剂:称取 0.2 g蒽酮和 1 g硫脲置于烧杯中,慢慢加入 100 mL浓硫酸,边加边搅拌,溶解后为黄色透明溶液。

葡萄糖标准溶液:先配成 1 g·L-1的葡萄糖溶液,然后分别吸取 1、2、4、6、8和 10 mL,分别置于100 mL容量瓶中,用蒸馏水定容,可得 10、20、40、60、80和 100 mg·L-1的葡萄糖溶液。

测定:吸取样液,系列标准糖液、蒸馏水各 1 mL,分别置于八支试管中,沿壁各加入 5 mL冷的蒽酮试剂,混匀,于试管口盖上玻璃盖,在沸水浴中加热 10 min,取出在流水中冷却 20 min后,在 620 nm波长下,以试剂空白调零,测定吸光值,作标准曲线。与标准对照,求出样品含糖量。

图1 标准曲线

1.3.3 工艺流程

大豆→清理→粉碎→水分调节→挤压膨化 (模孔孔径 18 mm、套筒温度 90℃、物料含水率 14%、螺杆转速 100 r/min)→粉碎→调节 pH值和温度→酶解(根据对不同酶的水解效果比较研究,选定 Al2 calase碱性内切蛋白酶)→灭酶→离心 (除去大豆油脂和乳状液)→收集上清夜→调节为等电点 pH蛋白沉淀→离心→取上清液 (测定水溶性糖)→95%乙醇沉淀→大豆水溶性多糖

↓

上清液离子交换 (脱盐、脱色)→真空浓缩→大豆低聚糖

1.3.4 计算公式

根据制作的标准曲线来计算大豆粉中水溶性糖得率:

1.3.5 酶解工艺的响应面优化试验

在单因素研究的基础上,结合水酶法提取大豆油和蛋白质的酶解工艺参数,选取加酶量、酶解温度、酶解时间、料水比和酶解 pH 5个因素为自变量,以总蛋白提取率为响应值,根据中心组合设计原理,设计响应面分析实验,其因素水平编码表见表 2。

表2 因素水平编码表

2 结果与分析

2.1 响应面试验安排及试验结果

应用响应面优化法进行过程优化。以 x1、x2、x3、x4、x5为自变量,以水溶性糖得率为响应值 Y,响应面试验方案及结果见表 3。1～26号为析因试验,27～36号为 10个中心试验,用以估计试验误差。

表 3 响应面试验方案及试验结果

续表

通过统计分析软件 SAS9.1进行数据分析,建立二次响应面回归模型如下:

回归与方差分析结果见表4,响应面寻优见表5,降维分析见图3,交互显著项的响应面分析见图4～图6。

表4 回归与方差分析结果

表5 响应面寻优结果

图3 各因素对考察指标的降维分析

图 5 Y=f(x2,x4)的响应面与等高线

由表 4可知,方程因变量与自变量之间的线性关系明显,该模型回归显著 (P<0.000 1),失拟项不显著,并且该模型 R2=96.95%,=92.88%,说明该模型与试验拟合良好,自变量与响应值之间线性关系显著,可以用于该反应的理论推测。由 F检验可以得到因子贡献率为:x5>x1>x2>x3>x4,即pH>加酶量 >酶解温度 >酶解时间 >料液比。由图 3可以看出各因素对考察指标大豆水溶性糖得率的影响规律。且由降维分析结果可知,酶解过程中大豆水溶性糖得率随加酶量增加先增加后不变,其原因是蛋白质水解到一定程度已经与水溶性糖分离充分。温度越高越有利于水溶性糖提取,但温度过高影响蛋白酶解效果,所以响应面寻优温度为 58℃。酶解时间对水溶性糖提取有较大值,出现在 3.5 h附近,因为在 3.5 h水解的大部分蛋白肽已经可以与水溶性糖分离。料液比对水溶性糖得率影响先增大后不变,因为载体水增多有利于酶与蛋白作用,而过多的水使底物与酶均被稀释。水溶性糖得率随 pH增大而增加,因为碱性条件下利于水溶性糖的提取与蛋白质溶解,但碱性过大对酶解不利,所以经过响应面优化 pH在 10附近有较大水溶性糖得率。

图 6 Y=f(x4,x5)的响应面与等高线

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析,寻找最优响应结果见表 5,由表 5实际值整理可知当加酶量为2.1%,温度为 58℃,酶解时间为 3.5 h,料水比为1:6.4,pH为 10,响应面有最优值在(20.98± 1.03)%。

由图 4可知加酶量与料液比呈现“协同”作用,并且在 1.8临界值附近出现“脊岭”区域,这与降维分析结果基本相同,但响应曲面优化与其结果矛盾,其原因是此两个因素与其他因素交互作用以及蛋白的水解程度对水溶性糖提取率影响造成的。由图 5可知酶水解温度与料液比呈现“拮抗”作用,并且其“脊岭”区域与响应面优化结果矛盾,说明水溶性糖的碱提最优温度和料液比与蛋白水解最优温度和料液比均对水溶性糖得率有很大影响,并且影响规律不一致。由图 6可知料液比与 pH对水溶性糖得率影响规律同降维分析结果以及响应曲面优化结果均一致,但 pH偏大,因为水溶性糖的碱提最优 pH与Alcalase碱性内切蛋白酶的水解最优 pH有差异。

2.2 验证试验与对比试验

在响应面分析法求得的最佳条件下,加酶量2.1%,温度 58℃,酶解时间 3.5 h,料水比 1:6.4, pH 10,水溶性糖得率有最优值在 (20.98±1.03)%。在此条件下进行3次平行试验,水溶性糖得率3次平行试验的平均值为 19.97%。验证值与预测值之间的标准偏差为 -1.01,在合理范围内,说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好。在相同的酶解条件下利用非挤压膨化物料进行酶解水溶性糖得率仅为15.43%。根据降维分析结果,结合以往碱提工艺条件,在碱提条件为:温度 80℃,时间 3.5 h,pH 10.5,料液比1:8条件下,水溶性糖得率仅为13.52%。

3 超微结构能谱分析

由图 7和表 6中 a与 b可以看出大豆膨化预处理前后N元素含量相同,而本试验轰击位点均为非蛋白体位点 (说明此部位为蛋白与水溶性糖混合物),说明挤压膨化预处理并没有使水溶性糖与蛋白复合物破坏,但挤压膨化再粉碎后大豆细胞组织破坏水溶性糖与蛋白复合物中蛋白质与蛋白酶作用位点较充分暴露,有利于其酶解使得水溶性糖与蛋白复合物破坏。由图 7中 c与 d可以看出膨化后大豆水解液中大颗粒与小颗粒 N元素含量差别很大,小颗粒含氮元素明显大于大颗粒,说明大颗粒为蛋白与水溶性糖混合物,而小颗粒为多肽。由此结果可以看出大豆中水溶性糖部分以糖与蛋白复合物形式存在,而要提取此部分大豆水溶性糖需要将蛋白水解。因此挤压膨化预处理工艺与水酶法提取工艺均有利于大豆水溶性糖得率的提高。挤压膨化过程中部分不溶性纤维降解为水溶性纤维同样可使水溶性糖得率提高。挤压膨化工艺参数对不溶性大豆纤维降解率影响规律需要进一步研究。

图7 扫描电镜观察与能谱分析结果

表6 能谱分析数据

4 结论

利用响应面分析方法对挤压膨化后大豆水酶法提取副产物 -水溶性糖得率进行了优化。建立了相应的数学模型为以后的中试以及工业化生产提供理论基础,并且得到了最优酶解工艺条件为加酶量为2.1%,温度为 58℃,酶解时间为 3.5 h,料水比为1:6.4,pH为 10,响应面有最优值在 (20.98± 1.03)%。经过验证与对比试验可知在最优酶解工艺条件下水溶性糖得率可达到 19.97%左右,比相同酶解条件下未经挤压膨化预处理水溶性糖得率以及碱提取工艺水溶性糖得率均有显著提高。利用超微结构能谱分析为手段,针对水溶性糖得率提高机理进行了研究,经研究表明:①挤压膨化再粉碎后大豆细胞组织破坏水溶性糖与蛋白复合物中蛋白质与蛋白酶作用位点较充分暴露,有利于酶解使得水溶性糖与蛋白复合物破坏。②大豆中水溶性糖部分以糖与蛋白复合物形式存在,而想要提取此类大豆水溶性糖需要将蛋白水解。所以挤压膨化预处理工艺与水酶法提取工艺均有利于大豆水溶性糖得率的提高。挤压膨化过程中部分不溶性纤维降解为水溶性纤维同样可使水溶性糖得率提高。挤压膨化工艺参数对不溶性大豆纤维降解程度的影响规律需要进一步研究。

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Enzyme-AssistantAqueous Extraction of Polysaccharides from Soybean By-product: Opti mization andMechanis m Study

Li Yang1Jiang Lianzhou1,2Zhang Zhaoguo3Wu Xia1Wu Haibo2Xu Jing1
(Food Science College NortheastAgriculture University1,Harbin 150030)
(The National Research Center of Soybean Engineering and Technology2,Harbin 150030)
(College of Engineering,NortheastAgriculturalUniversity3,Harbin 150030)

The conditions of enzyme-assistant aqueous extraction for oil are mild,and the protein in raw ma2 terial is hardly denatured during the extraction and the protein in the liquid phase after extraction can be reused or withdrawn after separation.However,there is little research on the soluble polysaccharides in the liquid phase.This experiment was aimed to study the soluble polysaccharides in the liquid phase after the enzyme-assistant aqueous ex2 traction of soybean oil and protein.Response surface methodology was used to optimize the soluble polysaccharides extraction with enzyme hydrolysis,and a correspondingmathematicalmodelwas established to provide practical rec2 ommendation and theoretical basis.Results:The optimal technologicalparameters for the soybean soluble polysaccha2 rides extraction are enzyme concentration 2.1%,temperature 58℃,enzyme hydrolysis time 3.5 h,material towater ratio 1∶6.4,and pH 10.Opti mal value of 20.98±1.03%was obtained on response surface.The soluble polysac2 charides extraction yield reaches 19.97%under the optimal conditions.The soluble polysaccharides extraction yield with extrusion and expansion pretreatment is significantly higher than that without extrusion and expansion pretreat2 ment.A mechanism study bymicrostructure and energy spectrum analysison the reasons about the increase of soluble polysaccharides yield was carried out.Results show the reasons are:1)Soybean cells are destroyed under extrusion and expansion followed by grounding during which action sites of soluble polysaccharides and protein compounds for protease are exposed and favorable to disruption of soluble polysaccharides and compounds.2)Part of soybean solu2 ble polysaccharides exists as form of compounds of soluble polysaccharides and protein.In order to obtain more solu2 ble polysaccharides,the compound protein needs to be hydrolyzed.

soybean soluble polysaccharides,response surface,enzyme-assistant aqueous extraction method

TS229 文献标识码:A 文章编号:1033-0174(2010)06-0031-06

农业部现代大豆产业技术体系建设项目(nycytx-004)

2009-07-08

李杨,男,1981年出生,博士,粮食、油脂及植物蛋白工程

江连洲,男,1960年出生,教授,博士生导师,粮食、油脂及植物蛋白工程