马春丽,张兰威

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.哈尔滨工业大学食品与工程学院,黑龙江哈尔滨 150090)

高产酸性能乳酸菌的筛选及产酸机理研究

马春丽1,张兰威2

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.哈尔滨工业大学食品与工程学院,黑龙江哈尔滨 150090)

为选择产酸性能优良的乳酸菌用于酸奶生产,本实验对生产酸奶常用的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的产酸能力进行了研究,测定了其发酵过程中滴定酸度和 pH的变化,并对其产酸机理进行了初探。研究结果表明,乳酸菌各菌株的产酸能力各不相同,菌株 T M111-S产酸速度较快,pH下降速度较快,发酵凝乳最终 pH较低。乳酸菌产酸能力与菌体细胞内β-半乳糖苷酶的量相关。筛选性能优良乳酸菌菌株对生产高质量的酸奶,提高工业化生产效率具有一定的意义。

酸奶,乳酸菌,酸度,β-半乳糖苷酶

在酸奶生产中使用的发酵剂菌种的性能直接关系到酸奶质量的好坏,筛选性能优良的菌株,对生产高质量的酸奶意义重大。产酸力是乳酸菌的重要特性,快速产酸的乳酸菌在发酵过程中可以缩短发酵时间,提高生产效率。本实验以生产酸奶的两种常用乳酸菌——保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的多个菌株为实验菌株,筛选其首要特性产酸能力强的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

菌株代号 T M111-S、G-3、3#、7#、9#、1.1#,东北农业大学食品学院贮藏;脱脂乳粉、邻-硝基酚(ONP) 购自中国医药集团上海化学试剂公司;邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG) 购自 Sigma公司;其它试剂 均为国产分析纯。

751-紫外可见分光光度计,冷冻离心机(Beckman),pHS-25型酸度计。

1.2 实验方法

1.2.1 实验菌株发酵性能测定 以 3%接种量将菌种接入 12%的灭菌脱脂乳中进行酸奶制作,每隔 1h取样测定酸度,同时测定 pH,以时间为横坐标,分别以酸度和 pH为纵坐标绘图,观察酸度变化。记录各菌株所制作酸奶的凝乳时间,测定凝乳时的酸度和pH,观察其组织状态,比较各菌株的发酵性能。

1.2.2 发酵酸度检测方法 发酵乳的酸度采用吉尔涅尔度(°T)表示;pH测定采用 PHS-25型酸度计直接测定。

1.2.3 发酵过程菌体乳糖酶的提取及活力测定

1.2.3.1 发酵过程菌体乳糖酶的提取 酸奶样品充分混合后取适量样品,每克酸奶样品溶于 20mg 1% EDTA(pH12,4℃)溶液中,离心 (4℃,5400×g, 10min),去除上清液,将菌体细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤两次。将菌体细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中,配成菌体浓度为 100mg/mL的悬液,采用 5%氯仿, 45℃保温 8～12h对菌体进行破壁,离心 (4℃,10000 ×g,10min),得无细胞酶提取液,待测酶活 (杨贞耐, 1989;J.P.Burton,1997)。

1.2.3.2 ONP标准曲线的绘制 浓度梯度为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14μmol ONP/mL,按下面方法制备:准确称取 139mg ONP于 1000mL容量瓶中,用 10mL 95%的乙醇溶解,用水稀释定容,混匀。用移液管分别取 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0mL上述配制溶液,分别加到 100mL容量瓶中,每个容量瓶中加入 25mL NaCO3溶液 (50g NaCO3和 37.2g EDTA于 1000mL容量瓶中,少量水溶解稀释),用磷酸盐缓冲液稀释,混匀。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。在分析过程中，多组间的数据比较处理采用One-way ANOVA方法进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

以水作空白,用 10mm比色杯在 420nm下测定每个ONP标准溶液的吸光值,以 ONP浓度为横坐标,吸光值(OD)为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.3.3 样品中乳糖酶活力的测定 采用 ONPG为酶作用底物,生成有色产物 ONP,通过比色法来测定,重复 3次取平均值。在此条件下,每分钟从培养基临-硝基酚-β-D-吡喃半乳糖苷 (ONPG)中释放出 1.30mmol临-硝基苯酚(ONP)所需的酶量定义为一个酶活单位(NLU)(C.G.Vinderola,2003)。

1.2.3.4 发酵液中β-半乳糖苷酶活力的测定 将活化后的菌种按 1%接种量接种于液体培养基中,37℃恒温培养一定时间,将发酵液离心 (5400×g, 15min),倾去上清液,取沉淀,用磷酸盐缓冲液洗涤两次,收集菌体,将其配成浓度为 100mg菌体/mL缓冲液的悬液,破壁,离心 (4℃,10000×g,10min),得无细胞酶提取液,待测酶活。

2 结果与分析

2.1 实验菌株的发酵产酸性能

将 6株乳酸菌菌株制备发酵剂,进行脱脂乳发酵实验,观察酸度变化(图 1)。

图 1 乳酸菌菌株发酵过程产酸曲线

由结果可以看出,不同菌株发酵产酸性能有差异,各菌株发酵酸度均随发酵时间的延长逐渐增大, pH逐渐降低。菌株 T M111-S、G-3发酵脱脂乳产酸性能较佳,pH下降较快。

在相同培养条件下利用各菌株制备发酵乳凝乳时酸度、pH和凝乳时间见表 1,结果显示,6株菌产酸能力顺序为 T M111-S、G-3、3、9、7、1.1,菌株T M111-S凝乳时间最短,产酸能力最高,凝乳时 pH最低,达到 4.78,因此选择快速产酸菌株直接关系到酸奶生产所需时间。

表 1 各菌株的发酵性能

2.2.1 ONP标准曲线的测定 ONP标准曲线的测定结果见图 2。该标准曲线的回归方程为 Y=4.3179X +0.0096,相关系数 R2=0.9991,其中 Y:420nm处的吸光度;X:邻硝基苯酚的浓度(μmol/mL)。

图2 ONP标准曲线

2.2.2 β-半乳糖苷酶在酸奶发酵过程中的活力变化

在脱脂乳发酵过程中对 T M111-S发酵剂菌体产生的糖代谢酶:β-半乳糖苷酶的活力进行测定,结果见表2。

表 2 β-半乳糖苷酶在酸奶发酵过程中的变化(¯X±SD,n=3)

随发酵时间的延长,β-半乳糖苷酶活性逐渐增强,酸度逐渐升高。乳糖经乳酸菌的作用一部分转变成乳酸,是通过乳酸菌的β-半乳糖苷酶作用,将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖,之后单糖被分解代谢产生乳酸。有研究表明,将乳糖经β-半乳糖苷酶分解代谢为葡萄糖和半乳糖的步骤为乳糖代谢的限速步骤。从结果可以看到,在酸奶制品发酵过程中,菌体细胞在此过程中始终产生β-半乳糖苷酶,并随发酵时间的延长,其活力逐渐上升。与此相对应,产生的乳酸量逐渐增加,pH逐渐降低。当β-半乳糖苷酶催化下产生的乳酸不足以抑制其活性时,它就会继续分解乳糖产生乳酸 (郭清泉,2002),使发酵乳的酸度继续升高。可见,乳酸的产生和β-半乳糖苷酶的活性呈正相关。

2.3 菌株在发酵液中酶活力的比较

经液体培养发酵一定时间后得菌体,进行酶活力的测定,测定菌株的酶活曲线如表 3所示。

表 3 菌株在发酵液中乳糖酶活力变化(¯X±SD,n=3)

菌株酶活力随培养时间的延长逐渐增大,但在发酵后期酶活力趋于平稳,可能是乳糖经β-半乳糖苷酶的分解所产生的乳酸,反过来又抑制β-半乳糖苷酶的活性。结果显示,T M111-S和 G-3产酶能力较强,这与它们产酸能力相对应。

3 结论

乳酸菌菌株间产酸能力存在差异,通过实验比较,T M111-S菌株产酸能力较强,乳酸菌产酸能力与发酵过程中产生的β-半乳糖苷酶的量具有相关性,本研究为高产酸菌株的筛选奠定了理论基础。

[1]陈铁涛 .克鲁维酵母培养特性及透性化细胞乳糖酶的研制与应用[D].东北农业大学硕士学位论文,1998.

[2]杨贞耐,骆承庠 .乳糖酶提取与纯化的研究[J].中国乳品工业,1989,17(4):147-152.

[3]J P Burton.Properties of porcine and yogurt lactobacilli in relation to lactose intolerance[J].J Dairy Sci,1997,80:2318 -2324.

[4]郭清泉 .普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的β-半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究 [J].食品工业科技,2002 (3):34-36.

[5]王璋 .食品化学[M].北京 .中国轻工业出版社,1999.

[6]C G Vinderola,J A Reinheimer.Lactic acid starter and probiotic bacteria:a comparative“in vitro”study of probiotic characteristics and biological barrier resistance[J].Food Research International,2003,36:895-904.

Study on screen ing of high acid-produing stra ins and mechan ism of acid-produing

MA Chun-li1,ZHANG Lan-wei2
(1.College of Food Science,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China; 2.College of Food Science and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

Lac tic ac id bac te ria(LAB)s tra ins we re se lec ted from S trep tococcus the rm op hilus(S.t)and Lac tobac illus bulga ricus(L.b)which we re w ide ly used in the p rep a ra tion of yogurt,and the ir ac id-p roduc ing cap ab ility was s tud ied in orde r to sc reen out high ac id-p roduc ing bac te ria from LAB.The changes in titrab le ac id ity and pH of s ix LAB s tra ins we re de tec ted during fe rm enta tion.The m echanism of ac id-p roduing about LAB was d iscussed.The results ind ica ted the ac id-p roduing cap ab ility was d iffe rent am ong s ix LAB s tra ins,and the T M111-S s tra in showed quicke r ra te of ac id-p roduing,s lowe r ra te of dec lining in pH and lowe r pH a t the end of coagula tion.The ac id-p roduing cap ab ility of LAB was re la ted w ith the content ofβ-ga lac tos idase in bac te ria ce lls.Sc reening of exce llent LAB s tra ins would have imp ortant s ignificance for p roduing high qua lity yogurt and acce le ra ting indus tria liza tion effic iency.

yogurt;lac tic ac id bac te ria;ac id ity;β-ga lac tos idase

TS252.1

A

1002-0306(2010)01-0189-03

2009-02-27

马春丽(1978-),女,博士研究生,研究方向:乳品科学。