范志影，刘宏超

（中国农业科学院饲料研究所，北京100081）

高效液相色谱法测定牛奶中的四环素类抗生素

范志影，刘宏超

（中国农业科学院饲料研究所，北京100081）

建立高效液相色谱法测定牛奶中四环素、土霉素、金霉素、强为霉素等4种抗生素残留的方法。样品经Mcllvaine缓冲溶液提取、OASIS HLB固相萃取柱净化后，经高效液相色谱分析，选定色谱柱SB-C18，5 μm,250mm×4.6mm i.d.，流速为1 mL/min，柱温为30℃，流动相为10 mmol/L三氟乙酸水溶液-乙腈（梯度洗脱），二极管阵列检测器，检测波长为360 nm，进样量为100 μL。以去甲基金霉素为内标物，四环素类标准溶液质量浓度在20～500 μg/L范围内呈良好的线性相关，相关系数大于0.999，检出限为5.95～18.85 μg/L；样品加标回收率在88.26%～107.98%之间，相对标准偏差在0.65%～6.14%之间。

四环素；抗生素；液相色谱；牛奶

0 引言

四环素类抗生素（Tetracyclines,TCs）是由链霉菌产生或经半合成制得的一类碱性广谱抗生素，兽医临床上常用的有：四环素（Tetracycline,TC）、金霉素（Chlorotetrcycline,CTC）、土霉素（Oxytetracy-cline,OTC）和强力霉素（Doxycycline,DC）等[1]。许多国家对四环素类药物残留实施例行监控，我国限量规定牛奶中最高残留量为100 μg/kg[1]。

高效液相色谱法在四环素类药物残留分析中应用最为广泛，采用二极管阵列检测器可得到色谱-光谱的三维图谱，可对组分峰进行定性定量分析，其灵敏度高，可实现低残留样本的准确定量。相关研究多采用外标法定量[2，3]，回收率不太理想。Ruyck(2007)[4]以去甲基金霉素为内标，液相色谱质谱联用法测定，得到了较好的试验结果，但分析成本较高。本研究以去甲基金霉素为内标，液相色谱二极管阵列检测器进行检测，结果令人满意。

1 实验

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国）配有二极管阵列检测器（PDA）（Waters 2998）和色谱工作站。

1.2 试剂

标准品：四环素盐酸盐（97.7%），盐酸土霉素（97%），金霉素盐酸盐（99%），盐酸强力霉素（98.7%），有去甲基金霉素（内标物）（98.5%）。

三氟乙酸、乙腈、甲醇均为色谱纯，其他试剂为分析纯。10 mmol/L三氟乙酸水溶液-乙腈（95+5）混合溶液。Mcllvaine缓冲溶液：将625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液和1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸（C6H8O7·H2O）溶液混合，调pH=4.0，加入60.05 g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O），使其溶解。

OASIS HLB固相萃取柱（3 mL）：使用前用5 mL甲醇、5 mL水活化。

1.3 标准溶液

质量浓度为100 mg/L标准贮备液：准确称取标准物质，分别用甲醇水溶液（1∶1，体积比）溶解，制成质量浓度为100 mg/L的标准贮备液。

混合标准工作溶液：取四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准贮备液各1 mL于100 mL容量瓶中，用浓度为10 mmol/L三氟乙酸水溶液-乙腈（95+5）混合溶液稀释定容，制成质量浓度为1 mg/L混合标准溶液。

内标溶液：移取去甲基金霉素标准贮备液1 mL于100 mL容量瓶中，用浓度为10 mmol/L三氟乙酸水溶液-乙腈（95+5）混合溶液稀释定容，制成质量浓度为1 mg/L内标溶液。

工作曲线系列溶液：准确量取一定体积的混合标准工作溶液和内标溶液，用10 mmol/L三氟乙酸水溶液-乙腈（95+5）混合溶液稀释，得到标准物质质量浓度分别为20，50，100，200，500 μg/L，内标物质量浓度为100 μg/L的标准系列溶液。

1.4 样品制备

取1 mL牛奶于10 mL离心管中（可在此步骤加入四环素标准物和内标物），加入4 mL Mcllvaine缓冲溶液，振摇5 min，于10 000 r/min转速下离心5 min，转移全部上清液，向提取液中加入2 mL正已烷，振摇后于4 000 r/min转速下离心5 min，移除上层正已烷，剩余溶液待净化。

将提取液通过活化好的OASIS HLB固相萃取柱，用5 mL水清洗小柱2次，抽干3 min，用4 mL乙腈洗脱，将收集的洗脱液于40℃水浴氮气吹干，用1 mL浓度为10 mmol/L三氟乙酸水溶液-乙腈（95+5）混合溶液复溶，通过0.45 μm滤膜后上机。

1.5 色谱条件

色谱柱：SB-C18，5 μm，250mm×4.6mm i.d.；流速为1 mL/min；柱温为30℃。流动相：浓度为10 mmol/L三氟乙酸水溶液（A）-乙腈（B），淋洗梯度为0 min（95%A），5 min(75%A)，10 min(65%A)，12 min(35%A)，14 min(35%A)，14.5 min(95%A)，20 min(95%A)。检测波长为360 nm。进样量为100 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

色谱柱选择SB-C18，5 μm,250mm×4.6mm i.d，流动相的选择参考文献[3]，采用浓度为10 mmol/L三氟乙酸水溶液和乙腈，选择适当的梯度洗脱程序，可实现色谱峰的基线分离，色谱图如图1所示。

2.2 仪器方法的精密度实验

选质量浓度100 μg/L标准溶液重复进7针，计算保留时间和峰面积的相对标准偏差（见表1）。结果表明，各化合物保留时间的变异小于0.08%，峰面积的变异小于1.22%，说明本方法所选择的仪器条件有较好测量精密度。

表1 仪器方法精密度实验结果（n=7）

2.3 工作曲线与检出限的测定

工作曲线系列溶液按照选定的色谱条件上机，以浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，检出限按S/N=3计算，线性方程、相关系数及检出限结果如表2所示。结果表明，在20～500 μg/L质量浓度范围内呈良好的线性相关，相关系数均大于0.999。4种化合物的检出限在5.95～18.85 μg/L之间，均远低于牛奶中四环素类药物100 μg/L的限量要求。

表2 四环素类抗生素的线性方程、相关系数及检出限

2.4 方法的回收率及精密度试验

选用不含有待测组分的牛奶样品，分别按照50，100，200 μg/L的质量浓度梯度加入4种四环素类药物混合标准溶液，每梯度做5个重复，并按100 μg/L的质量浓度加入去甲基金霉素内标物。按1.4的步骤处理样品，以内标法定量，测定加标回收率及方法的重复性（见表3），色谱图如图2所示。结果发现，只有金霉素加标100 μg/L组的回收率较低、变异较大，其他组的回收率均在92%～108%之间、相对标准偏差小于4%，说明此方法的回收效率高、精密度好。

表3 回收率实验结果（n=5）

图2 空白样品中添加100 μg/L四环素类药品的色谱

3 结论

本研究采用高效液相色谱二极管阵列检测器，以去甲基金霉素为内标，测定牛奶中的4种四环素类抗生素残留。本方法具有灵敏度高、准确度高、精密度好等优点，方法回收率在88.26%～107.98%之间，相对标准偏差均小于6.14%，检出限低于20μg/L，可满足对牛奶中四环素残留检测的要求。

[1] 中国兽药委员会.中华人民共和国兽药典兽药使用指南化学药品卷：2005年版[M].北京：中国农业出版社,2006：34.

[2] 刘勇军,吴银良,姜艳彬,等.固相萃取-高效液相色谱法测定畜禽肉与牛奶中5种四环素类药物残留及其稳定性研究[J].畜牧与兽医,2009（6）：65-67.

[3] 岳振峰,邱月明,林秀云,等.高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中四环素类抗生素及其代谢产物[J].分析化学,2006（9）：1255-1259.

[4] HENDRIK D R,HERMAN D R.Determination of Tetracycline Antibiotics in Cow’s Milk by Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007,21:1511-1520.

Determination of tetracycline antibiotics in cow’s milk by liquid chromatography

FAN Zhi-ying,LIU Hong-chao
（Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China）

A liquid chromatographic method for simultaneous quantitative determination of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline,doxycycline in milk has been developed.An extraction procedure consisting of a liquid extraction of the milk sample with Mcllvaine buffer solution was performed.Solid-phase extraction(SPE)with an OASES HLB SPE column was used to clean up the sample extracts.The samples were analyzed by liquid chromatography with diode array detector,the wavelength was 360 nm.The LC separation was performed on a SB-C18 column(5 μm,250 mm×4.6 mm i.d)using gradient elution with a mobile phase consisted of water containing 10 mmol/L trifluoroactic acid and acetonitrile,and the velocity of flow was 1 mL/min,the column temperature was 30℃.Demethylchlortetracycline used as internal standard(IS).The linearity was checked by standard solutions at concentration range from 20～500 μg/L,the correlation coefficients were larger than 0.999.The detection limits were between 5.95 to 18.85 μg/L.The recovery values ranged from 88.26%to 107.98%with relative standard deviations(RSDs)no larger than 6.14%.

tetracycline；antibiotics；liquid chromatography；milk

TS252.7

A

1001-2230（2010）12-0038-03

2010-10-09

范志影（1973-），女，助理研究员，从事动物营养及饲料检测技术方面的研究。