毛健，王豪，苏米亚，王荫榆，蔡涛

(1、食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2、光明乳业股份有限公司技术中心乳业生物技术国家重点实验室，上海200436)

开菲尔中生物活性物质的益生作用

毛健1，王豪2，苏米亚2，王荫榆2，蔡涛2

(1、食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2、光明乳业股份有限公司技术中心乳业生物技术国家重点实验室，上海200436)

开菲尔是通过开菲尔粒中的细菌和酵母发酵形成的乳制品，具有特殊的风味特征。在发酵过程中形成的肽和胞外多糖具有生物活性作用，体外和动物实验显示开菲尔具有抗癌、抗突变以及抗菌等功效。本文在综述了开菲尔中复杂的微生物及发酵过程中所形成的多种生物活性物质的基础上，评价了其对机体带来的一系列显著益生功能。

开菲尔；生物活性物质；益生作用

0 引言

开菲尔（Kefir）是一种源自于高加索山脉、具有特殊风味的发酵乳制品，拥有悠久的使用历史。许多世纪以前，高加索地区牧民发现新鲜的山羊乳或牛乳在随身携带的皮袋中会自然发酵形成一种起泡性饮料[1]，经长期使用后皮袋中会形成些许不规则颗粒，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中进行发酵。

如今，开菲尔在欧美等发达国家已达到工业化生产规模，该产品具有爽快的酵母风味，其中少量的乙醇和CO2赋予其特有的酒香味及杀口感，因此开菲尔被誉为发酵乳中的香槟[2]。虽然发酵过程中产生的多种多样的风味物质促成了开菲尔独特的口味，但可能并不是所有的人都能适应这种风味的发酵乳。有报道称添加果味物质，或者优化发酵过程（如添加某些乳球菌、乳杆菌或酵母菌）可一定程度上增加开菲尔的接受度[3]。

在日常膳食中摄入开菲尔可带来多重益生作用，据报道其拥有抑菌，免疫调节，抗肿瘤以及降胆固醇等作用[4-7]。开菲尔中除了包含大量的益生菌外，还含有L-乳酸，乙醛，3-羟基-2-丁酮，双乙酰等风味物质[8]，且在发酵过程中，维生素B1，B12，钙，氨基酸，叶酸和维生素K等营养因子的含量都有不同程度的上升[9]。

虽然开菲尔中的CO2含量与其它饮料相比相对较低，但由于开菲尔中的酵母菌会在保质期内继续生长，持续产生的CO2易导致产品发生胀包，因此开菲尔包装的耐压强度要求较高，且需具有一定的柔韧性，才能确保产品不受CO2分压增加的影响[10，11]。

1 开菲尔中的功能性成分

功能性食品目前受到越来越多消费者的青睐，其中的活性成分可提供益生作用并在一定程度上增强对疾病的抵抗。益生菌食品作为最受关注的功能性食品之一，主要包含以下几种生物活性物质：益生菌菌体本身（包括活菌和死菌），发酵过程中形成的微生物代谢产物（胞外多糖、细菌素等），以及食品基质的降解产物（生物活性肽等）。以下是开菲尔中三类主要的功能性成分：

1.1 益生菌

开菲尔粒（Kefir Grains,简称KG）是生产开菲尔的发酵剂，不同地区的KG菌相组成是有差别的，其中包含有多种乳酸菌（乳杆菌，乳球菌，明串珠菌），醋酸菌以及酵母菌等益生菌（详见表1和图1）。一般来说，KG中以乳酸菌数量和种类最多，其次是酵母菌和醋酸菌，但发酵条件的改变可能会影响到菌群的分布模式[12]。

KG中几种同型发酵的乳杆菌，特别是马乳酒样乳杆菌和高加索奶乳杆菌可产生大量的水溶性多糖，即开菲尔多糖，具有一定的生物保健作用。酵母菌在发酵乳品的生产中同样扮演着重要的角色，比如合成氨基酸和维生素等生长必需因子[13]。此外，KG中的酵母可为其中细菌的生长提供良好的环境[11]，这取决于KG中微生物菌群间的共生关系，这种共生体系有利于维持菌种间的相互稳定及菌株的生理功能。当菌种间的共生平衡被打破后，菌株的生长性能和生化活性都会发生降低。Garrote等[14]观察到，通过添加开菲尔假丝酵母，有助于发挥菌株间的共生效应，增强高加索奶乳杆菌在乳中的生长能力。同时，有研究观察到某些种类的酵母菌定位于开菲尔粒的表面，还有些则栖居于开菲尔粒内部，不同位置的酵母菌在发酵过程中发挥的作用可能不同[15]。

表1 开菲尔粒/开菲尔中的菌相分布

1.2 胞外多糖

图1 KG扫描电子显微镜图（A、C：内表面；B、D：外表面）

乳酸菌胞外多糖(LAB EPS）是指乳酸菌在其生长、代谢过程中分泌到细胞外的黏液或荚膜多糖。除了可以改善产品的质地如口感和黏稠度外，还具有多种潜在的生理功能。分泌EPS的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属和明串珠菌属等[16]，但是这些EPS在结构和组成上是不同的。开菲尔多糖（Kefiran）最初是从开菲尔粒中分离得到的一种EPS，单糖组分分析显示该多糖中D-葡萄糖和D-半乳糖的量浓度比为1∶1[17]。开菲尔多糖在冷水中溶解很慢，热水中可迅速溶解并在2%浓度下形成黏稠状液体，而羧甲基化开菲尔多糖的黏度比开菲尔多糖高出14倍，具有开发成食品级增稠剂的潜力[18]。有鉴于开菲尔多糖所具备的多种功能作用，很多研究者都在对其产量进行优化，如Mitsue等将能产生开菲尔多糖的马乳酒样乳杆菌和德氏有孢球拟酵母进行优化复配，在50 L的发酵罐中发酵7 d后，开菲尔多糖的产量可高达3 740 mg/L[19]。

1.3 生物活性肽

许多微生物拥有蛋白酶和肽酶，可以水解培养基或乳中的蛋白质，释放的肽和氨基酸可作为生长因子维持微生物的正常代谢[20，21]。在开菲尔粒中，益生菌所分泌的蛋白酶和肽酶可将蛋白质分解成几段长度不一的生物活性肽，具有潜在的功能作用，而且其种类和含量比普通发酵乳中更为丰富。在对土耳其开菲尔乳酸菌的研究中，Yuksekdag等发现21株乳球菌中有13株具有很强的蛋白水解能力[22]，Farnworth等则发现大部分开菲尔活性肽的分子量≤5000 ku[23]。

2 开菲尔的益生作用

在东欧，关于开菲尔益生作用的研究已有很长一段历史。开菲尔易于消化，其代谢产物对胃肠道疾病，代谢异常疾病，心血管疾病、免疫性疾病等均有一定的疗效。据报道，开菲尔含有抑制癌细胞增殖的荚膜多糖和溶解癌细胞的四碳二羧酸，可降低癌症的发病率。同时，开菲尔益生菌对大肠杆菌，沙门氏菌等病原菌均有强烈的抑制作用，经常食用开菲尔制品可在人体胃肠道中保持有益菌群的优势作用。目前，针对开菲尔益生作用的研究主要集中在以下几个方面：

2.1 刺激免疫系统

免疫调节作用可能是益生菌所发挥的多种功能性作用中较为常见的一种益生机制，这不仅与其菌体本身有直接联系，还与发酵过程或消化过程中所形成的活性物质有关，如某些寡肽表现出多种生理功能活性，其中就包括免疫系统刺激作用[24]。

Thoreux等[25]采用开菲尔饲喂6月龄的幼鼠，发现其体内黏膜免疫应答显著增强；与对照组相比，霍乱毒素特异性IgA抗体的产生水平也明显提高。Thoreux等认为开菲尔对黏膜免疫系统有辅助调节作用，这可能来源于开菲尔中益生菌的细胞壁组分。

KG中的EPS也可能表现出免疫调节功能。Murofushi等[26]从开菲尔粗多糖中纯化制备出一种水溶性多糖来喂养小鼠，观察到小鼠肿瘤增生速率显著下降，研究称这与细胞介导的免疫响应有关，且多糖的使用剂量直接决定了免疫调节效果。此外，Furukawa等[27]也发现KG中一种水溶性多糖具有免疫调节作用，研究显示，该多糖与荷瘤小鼠肠淋巴结细胞（PP Cell）共培养的混合物上清可促进正常小鼠脾细胞的增殖，并增强脾细胞中脂多糖（LPS）和植物血球凝集素P（PHAP）的有丝分裂活性。他们认为开菲尔多糖可通过刺激PP细胞，诱导其分泌水溶性免疫因子，提高正常小鼠中胸腺细胞和脾细胞的有丝分裂响应水平，该EPS对免疫系统的效果取决于宿主本身的健康程度。

先天性免疫可保护机体组织和循环系统免受病原体侵害，是免疫反应中的第一条防御线，其中巨噬细胞在治疗感染的过程中起着重要作用。开菲尔可调节小鼠的免疫应答，增加肠道和支气管黏膜的IgA+细胞数，同时增强腹膜和肺部巨噬细胞的吞噬活性[28-29]。Gabriel Vinderola等[30]通过研究先天性免疫细胞（腹膜巨噬细胞和派伊尔结黏附细胞）所产生的细胞因子，评价了开菲尔中两部分功能物质（F1：开菲尔菌体；F2：开菲尔发酵上清）的免疫调节能力。实验中连续喂食小鼠F1或F2七天后，可上调腹膜巨噬细胞中TNFα及IL-6的产生水平，派伊尔结细胞因子如IL-1α、IL-6、IL-10等也都得到促进。此外，与F1相比，F2可诱导并显著增加派伊尔结黏附细胞中IL-10+细胞的所占比例。研究结果称，F1和F2在体内可作为生物治疗物质发挥作用，能刺激先天性免疫系统中的免疫细胞增殖，下调Th2型免疫反应，促进细胞介导的肿瘤免疫响应，同时减少胞内病原体所引起的感染。

开菲尔还具有抗过敏和抗炎症效果，对过敏性支气管哮喘的治疗具有潜在疗效。Lee MY等[31]采用卵清蛋白(OVA)致敏、激发大鼠产生气道炎症和气道重塑，建立哮喘动物模型来研究开菲尔的药理学作用。在使用卵清蛋白激发大鼠之前，预先对大鼠胃部注射开菲尔（50 mg/kg）并作用1 h，发现开菲尔可显著抑制由卵清蛋白所诱导的气道高反应（AHR）；此外，胃部内注射开菲尔还可明显抑制炎症细胞总数的增加，肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞的增加也受到抑制。肺泡灌洗液中Th2型细胞因子，诸如IL-4、IL-13，总免疫球蛋白E也降低到了正常水平。组织学研究显示，开菲尔除了可显著阻遏肺部嗜酸粒细胞增多，还对气道中杆状细胞黏液的高分泌具有抑制作用。

2.2 抑制肿瘤增生

Shiomi等首次报道了KG中的一种水溶性多糖（分子量约为1 000 ku）具有抗肿瘤作用[32]，研究显示口服或腹腔注射该多糖后，小鼠体内艾氏癌细胞的扩散及恶性毒瘤-180的增生得到了有效抑制。Murofushi等[26]在体外实验中发现，开菲尔多糖与两种癌细胞系共育42 h后，细胞毒性明显降低；体内实验显示，该水溶性多糖经口服后可到达小鼠的脾脏和胸腺中，通过T细胞来介导基于胸腺依赖性和非胸腺依赖性的抗原响应，增强免疫活性。

开菲尔多糖还可显著抑制Lewis肺癌的生长和转移，且即便在肿瘤发生转移后，通过服用大剂量的KG多糖仍可达到抗肿瘤效果[33]。除水溶性多糖外，一种含KG菌群的非水溶性多糖也可显著抑制高移植性B16黑素瘤的转移[34]，研究称水溶性多糖是通过刺激肠道相关淋巴组织分泌淋巴因子激活巨噬细胞，从而抑制肿瘤增生；而含有开菲尔菌体的非水溶性多糖则是通过增强自然杀伤细胞的活性来发挥作用。

Furukawa等[5]研究发现，当小鼠接种Lewis肺癌肿瘤后，采用插管法喂食开菲尔（2 g/kg体重）9 d，要比普通酸奶更能有效抑制肿瘤增生。虽然平均存活时间没有变化，但是服用开菲尔的荷瘤小鼠与未服用开菲尔的荷瘤小鼠相比，其迟发型超敏反应得到了有效改善[6]。此外，小鼠服食开菲尔（100～500 mg/kg体重）后还可抑制艾氏腹水癌细胞的增殖[35]，Cevikbas等[36]则发现对小鼠腹腔注射开菲尔滤液（经过滤除去KG）后，可杀灭或抑制由7,12-二甲基苯并蒽诱导的梭形细胞肉瘤增生。

Hosono等[37]从蒙古开菲尔中分离出了链球菌、乳杆菌和明串珠菌，体外实验显示这些菌株可与氨基酸热解产物牢固结合，而氨基酸热解产物是一种普遍存在于食品中的潜在诱变剂。Miyamoto等[38]同样也报道了3株于德国开菲尔中分离到的产黏乳链球菌乳脂亚种具有显著的去致突变效应，能与某些已知的诱变剂牢固结合。Yoon等[39]采用经典的致癌物质筛选法-艾姆斯实验发现，分离自开菲尔中的乳杆菌对诱变剂2-硝基芴有很强的抗突变能力。Liu等[40]也评估了开菲尔发酵牛奶及发酵豆奶的抗突变能力，发现其对鼠伤寒沙门氏菌中的各种诱变剂如亚硝基胍、4-硝基喹啉所诱导的突变具有很强的抑制能力。

此外，Liu等[41]还研究了KG发酵牛奶和发酵豆奶对小鼠体内肿瘤增生的影响，在饲喂开始前先对小鼠注射0.2×108的肉瘤180细胞，而后持续30 d喂养实验，结束后将肿瘤取出并称重。与对照组相比，开菲尔豆奶和开菲尔牛奶均能显著抑制体内肿瘤增生，而喂食未发酵豆奶的小鼠体内肿瘤体积没有减小。肿瘤显微观察显示，肿瘤细胞凋亡可能是导致肿瘤增生速度下降的直接原因。Liu等认为开菲尔中益生菌本身或发酵过程中形成的胞外多糖可诱导抗瘤免疫响应的发生。Genistein（酪氨酸蛋白激酶抑制剂）对肿瘤有抑制作用，但在该研究中并未发现genistein水平有任何变化。

Guven等[42]认为开菲尔还可选择性保护机体组织器官，他们发现灌胃开菲尔的小鼠与四氯化碳（一种可诱导氧化损伤的肝毒素）接触后，其肝脏和肾脏中丙二醛含量显著降低，表现出很强的抗氧化活性，且抗氧化效果要强于维生素E，能有效保护机体免遭氧化损伤。Liu等[40]也发现开菲尔发酵乳，包括发酵牛乳及发酵豆乳均可显著增强DPPH自由基的清除能力，并可抑制亚油酸的过氧化，具备很强的还原能力。

2.3 缓解乳糖不耐症

国内有较大部分人群由于缺乏β-半乳糖苷酶（或乳糖酶），导致不能有效消化乳糖。然而有研究显示，乳糖消化不良者可以饮用含大量益生活菌的酸奶。酸奶的缓冲体系可维持其中益生菌的细胞活性及其细胞壁完整性。因此，酸奶菌种（尤其是嗜酸乳杆菌）中β-半乳糖苷酶的活性在从胃部到上胃肠道的传输过程中可得到有效保护[43]。与纯牛乳相比，发酵乳在胃肠道中的运输时间更短，可减少乳糖不耐症的发生几率[44]。

Hertzler等[45]采用含6株乳酸菌和1株酵母菌的商用发酵剂生产的开菲尔可以有效降低成年乳糖消化不良患者的氢气呼出量，同时腹部胀气现象也得到明显改善。De Vrese等[46]动物实验表明，与服食热灭活的开菲尔相比，服食含有活性KG的开菲尔后，猪血清半乳糖浓度明显上升；且添加了开菲尔的食物中β-半乳糖苷酶活性为4.4 U/L，可有效水解肠道中的乳糖，促进乳糖吸收。

2.4 抗菌作用

乳酸菌可产生广谱的抗菌物质，包括有机酸（乳酸和乙酸）、二氧化碳、过氧化氢、乙醇、双乙酰和抗菌肽等（细菌素），它们不仅能减少食源性致病菌和污染菌所引发的疾病，而且可预防并治疗胃肠道功能紊乱和阴道感染[47，48]。

Garrote等[49]检测了KG发酵乳上清对G-菌和G+菌的抑制作用，发现G+菌更易受到开菲尔上清的抑制，该上清中含有大量的乳酸和乙酸；当往牛乳中添加与开菲尔上清中相同浓度的乳酸和乙酸后，会对大肠杆菌产生抑制作用，有鉴于此，他们认为开菲尔发酵过程中产生的有机酸有明显的抑菌作用，即使在发酵早期作用同样明显。

KG虽然可以抑制金黄色葡萄球菌，克雷伯氏肺炎杆菌以及大肠杆菌的生长，但不会抑制酵母菌如白假丝酵母和酿酒酵母的生长。分离自KG中的植物乳杆菌和肠膜明串珠菌产生的抗菌物质可抑制G+和G-菌，该细菌素分子量约为1 000 ku，具有热稳定性，对蛋白水解酶敏感。Santos等研究显示[50]，分离自KG中的乳杆菌对大肠杆菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺菌和小肠结肠炎耶尔森菌都表现出明显的抑制作用，这可能也与乳酸菌所产的细菌素有关。

过氧化氢是菌体代谢产生的另一种抗菌物质。Yuksekdag等研究指出[51]，从土耳其开菲尔中分离出的21株乳酸菌可产生0.04～0.19 μg/mL的过氧化氢；此外，他们还报道有21株开菲尔来源的乳球菌也可产生过氧化氢，所有的乳球菌均可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，但是对大肠杆菌NRLL B-704和铜绿假单胞菌的抑制效果较差[22]。

2.5 调节胃肠道功能

益生菌的评价标准中有一个很重要的指标，那就是对胃肠道环境的耐受性，主要指对胃部极端pH环境、胆盐和消化酶作用的抵抗力。益生菌只有具备较强的抗逆性能力，才能顺利到达小肠，与病原菌竞争结合位点，黏附并定殖于肠上皮细胞，产生特殊的抑制或易位效果来调节肠道菌群平衡。

开菲尔可缓冲消化过程中胃部的低pH值，为其中益生菌在胃肠道转运过程中提供保护作用。Santos等[50]从不同来源的KG中分离出副干酪乳杆菌，植物乳杆菌，德氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌和马乳酒样乳杆菌等58株乳杆菌，发现所有菌株均能在pH2.5的MRS培养基中存活4 h，但并不能生长繁殖；有85%的菌株对0.3%的胆盐表现出耐受性，但是生长缓慢。

通过对人体粪便样品进行分析，可以研究膳食对人体肠道微生物菌群的影响。Marquina等[52]采用开菲尔连续喂食小鼠7个月后，发现小鼠的小肠和大肠中的乳酸菌数目明显增加。链球菌数增加了1个数量级，而亚硫酸盐还原梭菌数则降低了2个数量级。

尽管有很多研究证实了开菲尔对宿主肠道微生物菌群的影响，但是很少有研究分析开菲尔对肠道酶系的影响。Elena Urdaneta等[53]将雌性小鼠分成两组，一组采用标准膳食喂食，另一组则采用添加了开菲尔的膳食喂养，连续22 d，每日记录食物的摄取量以及体重指标，同时测定血清中的葡萄糖，尿酸，胆固醇，甘油三酸酯以及碱性磷酸酶含量。肠道酶分析显示，服食开菲尔膳食的小鼠小肠刷状缘膜囊中的氨肽酶N活性显著增强，且血糖过多症状也得到了改善，表明开菲尔可改善蛋白质消化水平并有效降低体内高血糖水平。

2.6 降胆固醇作用

已有大量文献证明益生菌发酵乳可加速胆固醇代谢，并且这种益生作用较常规的临床药物更为温和。关于益生菌降胆固醇的作用机理有几种假设，如细胞同化或结合胆固醇、产生胆盐水解酶释放出游离胆酸并与胆固醇发生共沉淀等。

Vujicic等研究表明[54]，源自塞尔维亚、匈牙利和高加索区域的KG可同化牛乳中的胆固醇，在20℃下发酵24 h后可降低基质中62%的胆固醇，在10℃下贮藏48 h后胆固醇降低率增至84%。他们认为KG的降胆固醇能力可能来源于其特有的胆固醇降解酶系。此外，在一项以安慰剂为对照组设计的双盲临床试验中，13人每日服食开菲尔并持续4周（500 mL/天）后，血清甘油三酸酯含量相对于基线水平有所降低，而血清高密度脂蛋白（HDL）含量与基线相比有一定程度增加，低密度脂蛋白（LDL）/HDL比率下降[55]。

3 结论

开菲尔菌相分析显示，开菲尔中含有比普通酸奶更为复杂的益生菌。KG中的细菌和酵母菌错综交结，且由于共生关系的存在，导致单一菌株的分离鉴定难度增大，目前大部分开菲尔菌种是通过分子生物学技术鉴定的。不同来源的KG所生产的开菲尔从菌相到功能性方面可能都不完全一致，这也为开菲尔的深入研究带来一定困难。

开菲尔的制备取决于KG中微生物菌群的协同增效作用。在发酵过程中，KG中的乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等微生物会产生多种风味物质和多糖等功能性成分，赋予开菲尔特殊的风味及质构。在发酵后，开菲尔中含有较多的生物活性物质，开菲尔多糖是其中的研究焦点。开菲尔中多数益生菌含有特异性蛋白酶，可水解酪蛋白或乳清蛋白从而释放大量的生物活性肽，不仅可改善消化系统，还可促进人体的代谢功能和免疫功能。

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Study on probiotic effect originated from bioactive ingredients in kefir

MAO Jian1，WANG Hao2，SU Mi-Ya2，WANG，Yin-Yu2，CAI Tao2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Wuxi 214122,China;2.China State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Technology Center Bright Dairy&Food Co.,Ltd,Shanghai 200436,China)

Kefir is a dairy product fermented by live bacteria and yeasts contained in kefir grains,and is reported to have a unique taste and unique properties.During fermentation,peptides and exopolysaccharides are formed that have been shown to have bioactive properties.Moreover,in vitro and animal trials have shown kefir have anticarcinogenic,antimutagenic,antiviral and antimicrobial properties.The aim of this article is to evaluate a long list of significant probiotic function of kefir,which is on the basis of complex microorganisms and the variety of possible bioactive compounds formed during fermentation.

kefir,bioactive ingredients,probiotic effect

TS935,Q936

B

1001-2230（2010）12-0030-06

2010-08-09

毛健（1970-），男，副教授，从事食品发酵技术方面的研究。

王荫榆