李倩，宁德刚，吴春笃

1 江苏大学环境学院，镇江 212013 2 江苏大学生命科学研究院，镇江 212013

以CotX为分子载体在枯草芽胞杆菌芽胞表面展示绿色荧光蛋白

李倩1,2，宁德刚1，吴春笃1

1 江苏大学环境学院，镇江 212013 2 江苏大学生命科学研究院，镇江 212013

芽胞衣壳蛋白CotB、CotC、CotG等可作为芽胞表面展示外源蛋白的分子载体，制备口服重组疫苗或具有催化活性的重组酶。CotX为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis芽胞衣壳中的另一种结构蛋白。为证明CotX能否作为分子载体将外源蛋白展示在芽胞表面，本研究将 cotX基因与绿色荧光蛋白基因 gfp的编码序列进行基因重组，构建融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒，将该质粒转化枯草芽胞杆菌，筛选重组菌株并诱导产生芽胞，观察到重组芽胞表面具有GFP绿色荧光。结果表明枯草芽胞杆菌的芽胞衣壳蛋白CotX位于芽胞衣壳外层，可作为芽胞表面展示外源蛋白的载体分子。

枯草芽胞杆菌，芽胞表面展示，CotX，绿色荧光蛋白

Abstract:Spore coat proteins, such as CotB, CotC, CotG et al, are able to efficiently display exogenous protein on spore surface for preparing oral vaccines or enzymes.CotX is another structural protein of spore coats of Bacillus subtilis.To investigate whether CotX could carry target protein onto the spore surface, we constructed a recombinant integrative plasmid, designated as pJS749,which carries a recombinant cotX-gfp gene under the control of the cotX promoter.We transformed pJS749 into Bacillus subtilis 168(trp-), an α-amylase inactivated mutant DRJS749 was selected and confirmed to be a double crossover integrant, where cotX-gfp fragment was integrated into the chromosome.After induction of spore formation, significant green fluorescence was observed on spore surface of strain DRJS749 under fluorescent microcopy.This suggests that CotX is associated with the outer part of the coat.CotX can therefore be used as a molecular vehicle for spore surface display of exogenous proteins.

Keywords:Bacillus subtilis, spore surface display, CotX, GFP

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis在营养缺乏等逆境条件诱导下，营养细胞分化形成休眠体——芽胞。芽胞由皮层、芽胞衣壳和芽胞外壁构成。外层的芽胞衣壳主要由疏水的衣壳蛋白构成，具有抗酶解、抗药物功能。芽胞的形成是一系列调控基因和结构基因按一定时序调控表达的过程。这些基因包括芽胞衣壳蛋白基因以及调控基因，如cotA、cotB、cotC、cotF、cotG 等20余种[1]。由于芽胞的特殊结构使其具有独特的抗逆性，能在极端环境(如高温、干燥、化学药物)中长期存活，能顺利通过动物消化道屏障等特点，以芽胞衣壳蛋白为分子载体，通过芽胞表面展示技术将外源目的蛋白展示于重组枯草芽胞杆菌芽胞表面，制备具有生物活性的重组芽胞的研究倍受关注[2-3]。已有报道成功利用枯草芽胞杆菌芽胞衣壳蛋白CotB[4]、CotC[5]以及CotG[6]为分子载体，将具有免疫保护作用的抗原蛋白或酶展示于芽胞表面，构建具有免疫学功能或催化活性的重组芽胞。

由于不同的芽胞衣壳蛋白的分子结构，以及在芽胞中的组成存在差异，导致不同的芽胞衣壳蛋白作为分子载体表面展示外源蛋白的重组芽胞生物学活性也不同[4-5]；利用芽胞表面展示技术同时展示多种不同抗原蛋白或酶，制备多价重组抗原疫苗或不同催化酶的重组芽胞，需要多种具有运载功能的衣壳蛋白作为载体。但在已报道的20余种枯草芽胞杆菌芽胞衣壳蛋白中，只有部分衣壳蛋白位于芽胞衣壳的外层，但它们在芽胞衣壳中的准确位置以及暴露于芽胞表面的结构域并不清楚[1]，能否作为分子载体将外源蛋白展示于芽胞表面需要通过实验证明。因此，筛选新的能有效展示外源目的蛋白的载体分子，用于芽胞表面展示外源蛋白尤为关键。本研究以绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)基因(gfp)为报告基因，以枯草芽胞杆菌芽胞衣壳蛋白CotX为分子载体，通过芽胞表面展示技术将GFP展示于芽胞表面。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和培养条件

用于质粒克隆的宿主菌 E.coli DH5α在37℃LB培养基中培养，含有质粒的大肠杆菌加入相应的抗生素(氨苄青霉素工作浓度均为 50 μg/mL)。Bacillus subtilis 168(trp-)来源于 Bacillus Genetic Stock Center，Department of Biochemistry，The Ohio State University。质粒 pBAD-gfpuv[7]由中国科学院水生生物研究所徐旭东研究员提供。pJS700a由本实验室构建，其他质粒均为本实验室保存。

1.2 分子生物学操作

DNA重组按标准操作方法进行[8]，枯草芽胞杆菌染色体的提取参照文献[9]。PCR反应体系中含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50 mmol/L MgCl2，引物各 100 pmol，200 μmol/L dNTPs，50 ng 模板 DNA，2.5 U DNA聚合酶。反应程序为：94℃变性5 min；94℃1 min，58℃ 1 min，72 ℃ 1 min ，30个循环；72℃延伸5 min。含gfp编码序列的片段以gfp-a(5′-GGTAC CGCTAGCAAAGGAGAAG-3′)、gfp-b(5′-GAATTCT GCAGGTCGACTCTAGAGG-3′) 为 引 物 ， pBADGFPuv为模板进行 PCR扩增。含 cotX的片段以cotX-a(5′-GTCTAGATTACTTTGTCTGCCGACGAGA-3′)、cotX-b(5′-GGTACCGAGGACAAGAGTGATAA CTAGGATG-3′)为引物，以 Bacillus subtilis 168(trp-)染色体DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物或酶切产物用凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)回收后用于克隆。用于枯草芽胞杆菌重组菌株鉴定的引物为 amyE-11:5′-GAGATCTC ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG-3′和 amyE-22:5′-GTTACACCATCACTGTTCGTTCC-3′。反应程序为：94℃变性 5 min；94 ℃ 1 min ，58 ℃ 1 min ，72 ℃ 3 min，30个循环；72℃延伸5 min。

DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pMD-18T等均购自宝生物(大连)有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，来源于PCR产物的克隆片段由上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定。

1.3 枯草芽胞杆菌的转化

以两步法制备Bacillus subtilis 168(trp-)感受态细胞[10]，枯草芽胞杆菌的转化参照文献[10]进行。用含0.4 μg/mL红霉素的LB平板于37℃培养筛选转化子。

1.4 枯草芽胞杆菌淀粉酶活性分析

从平板上挑枯草芽胞杆菌单菌落接种在 3 mL液体LB培养基中培养过夜，取5 μL菌液涂于含1%淀粉的LB平板上，37℃培养16 h，取2 mL碘液喷于淀粉平板上，并对染色平板拍照。碘液的配制：碘化钾2 g，碘1 g，先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300 mL，保存在棕色玻璃瓶内。

1.5 枯草芽胞杆菌芽胞的诱导和显微拍摄

以 DSM培养基诱导 Bacillus subtilis 168(trp-)或重组菌株DRJS749形成芽胞[9]。DSM培养基的配制：0.8%肉汤营养液(Difco)，0.1% KCl，0.025%MgSO4·7H2O，1.0 mmol /L Ca(NO3)2，10 μmol /L MnCl2，1.0 μmol/L FeSO4。取 Bacillus subtilis 168(trp-)或重组菌株DRJS749单菌落接种于3 mL DSM 培养基中，37℃振荡培养40 h，5000 r/min离心10 min收集芽胞，重悬于1 mL无菌水中。以终浓度为2 mg/mL溶菌酶37℃处理30 min破坏营养细胞，5000 r/min离心10 min沉淀芽胞，加1 mL水重悬芽胞。取10 μL芽胞悬液涂于载玻片上，盖上盖玻片，利用装置在Leica DFC300FX 荧光显微镜上的 LEICA QWIN LITE 图像分析软件辅助的 Leica DFC300FX冷 CCD数码摄像头进行拍摄。GFP 荧光通过 Sapphire GFP 滤光片组件(激发光滤光片BF470/40，dichromatic mirror：500，发射光滤片：BP 525/50)观察，拍摄快门速度为270 ms。

2 结果

2.1 融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒及重组菌株的构建策略

为证明 CotX能否作为载体将外源蛋白展示于芽胞表面，以 gfp为报告基因，构建融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒(图1)。在枯草芽胞杆菌整合平台质粒 pJS700a中，含 Bacillus subtilis 168(trp-)淀粉酶基因 amyE 片段(547～1643 nt)，在该片段中的Sma I位点插入红霉素抗性基因Emr，下游含多克隆位点。分别将cotX及gfp编码序列插入pJS700a中，得到含融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒。该重组质粒转化枯草芽胞杆菌，通过质粒上的 amyE 片段与宿主染色体上的同源片段双交换重组获得枯草芽胞杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生重组芽胞，观察重组芽胞表面GFP的表达。

2.2 重组质粒pJS747的构建

根据 Bacillus subtilis 168染色体上的 cotX(GenBank Accession No.NP_389058)序列，设计并合成引物cotX-a和cotX-b。为便于克隆，上游引物cotX-a添加了Xba I位点，下游引物cotX-b添加了Kpn I位点。以 cotX-a和 cotX-b为引物，Bacillus subtilis 168(trp-)染色体DNA为模板，扩增含cotX基因的启动子和不含终止密码子的编码序列，扩增产物大小为890 bp，回收并克隆于pMD-18T载体中，测序确定克隆片段正确后命名pJS738。以Xba I和Kpn I完全酶切 pJS738，回收 cotX片段，克隆于pJS700a相应位点，重组质粒命名为pJS747(图2)。

2.3 融合表达CotX-GFP整合型重组质粒的构建

以gfp-a和gfp-b为引物，质粒pBAD-GFPuv 为模板，扩增含gfp基因的编码序列片段(约774 bp)，并克隆于pMD-18T载体中，测序确定序列正确后命名为pJS289。以Kpn I和EcoR I完全酶切pJS289，回收gfp片段，并克隆于pJS747相应的位点，使cotX和 gfp的编码序列处于同一阅读框中，得到的整合型重组质粒命名为pJS749(图2)。该质粒中含来自Bacillus subtilis 168(trp-)染色体上的淀粉酶基因的5′端和 3′端的 DNA 片段；供 Bacillus subtilis 168(trp-)转化子筛选的红霉素抗性基因 Emr；以及融合表达CotX-GFP的重组基因片段，该片段含cotX启动子序列、不含cotX终止密码子的CotX编码序列和GFP的全编码序列，该重组基因由cotX启动子控制，在诱导芽胞分化时融合表达CotX-GFP。

2.4 融合表达 CotX-GFP重组枯草芽胞杆菌的构建

为构建融合表达 Cotx-GFP的重组枯草芽胞杆菌，以BglⅡ酶切质粒pJS749使其线形化，并转化Bacillus subtilis 168(trp-)。因重组质粒上的整合片段可与染色体上的同源片段双交换重组，淀粉酶基因因插入重组片段 Emr-cotX-gfp失活，融合表达CotX-GFP的重组基因整合于染色体上(图4A)。为筛选 Emr-cotX-gfp插入淀粉酶基因 amyE中的转化子，将其接种于淀粉平板，培养后以碘液染色，转化子及其周围被碘液染成蓝色，对照菌株 Bacillus subtilis 168(trp-)菌落及周围产生透明的淀粉水解圈(图3)。表明转化子中的淀粉酶基因失活，Emr-cotX-gfp片段通过插入淀粉酶基因而整合于重组菌株的染色体上。

图1 融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒构建流程图Fig.1 Construction of integrative recombinant plasmid for fusion expression of CotX-GFP.amyE 5'-end and amyE 3'-end are integrative fragments from amylase gene of Bacillus subtilis 168(trp-), Emr: gene resistant to erythromycin; Apr: gene resistant to penicillin; OriC:replication origin of E.coli.

图2 重组质粒pJS738和pJS749的鉴定Fig.2 Examination of plasmid pJS738 and pJS749 by PCR and enzyme digestion.1: λDNA/Hind Ⅲ; 2: pJS700a digested by BamH I; 3: pJS747 digested by BamH I; 4: pJS749 digested by BamH I; 5: identification of pJS747 by PCR using cotX-a/cotX-b as primers; 6: identification of pJS749 by PCR using cotx-a/gfp-b as primers.

为进一步证明重组菌株中淀粉酶基因的失活是由于 Emr-cotX-gfp的插入所致，分别以 amyE-11/amyE-22、cotX-a/gfp-b为引物，染色体为模板，PCR扩增鉴定重组菌株，分别检测到约4.0 kb和1.7 kb的扩增片段。表明重组菌株染色体上含有 cotX-gfp重组基因，并且Emr-cotX-gfp重组片段插入淀粉酶基因中(图4)。将鉴定后的转化子命名为DRJS749。

2.5 表面展示gfp的重组芽胞鉴定

图3 重组菌株DRJS749淀粉酶活性分析Fig.3 Identification of DRJS749 by analysis of amylase activity.(A)Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749 were grown on LB plates containing 1% starch.(B)The plate was stained with iodine to detect the a-amylase activity, which was indicated by the transparent plaque.

将重组菌株DRJS749接于DSM培养基中培养，分别于20 h和40 h取菌液滴于载玻片上，以Bacillus sutilis 168(trp-)为对照，荧光显微镜观察细胞荧光。培养 20 h的重组菌株 DRJS749和 Bacillus sutilis 168(trp-)均为营养细胞，荧光显微镜下均未观察到绿色荧光(数据未显示)；而培养40 h后细胞分化成芽胞，重组菌株DRJS749的芽胞表面具有显著的绿色荧光；在相同的条件下，Bacillus sutilis 168(trp-)芽胞未见绿色荧光(图6)。表明重组菌株营养细胞不表达GFP；当诱导产生芽胞时，在cotX启动子控制下表达CotX-GFP，GFP通过芽胞衣壳蛋白CotX展示于芽胞表面。

图4 菌株DRJS749中重组基因片段的鉴定Fig.4 Identification of the recombinant fragment of DRJS749.(A)Schematic diagram of the integration of Emr-cotX-gfp in chromosome.(B)PCR examination of Emr-cotX-gfp fragment integrated into the chromosome of Bacillus subtilis 168(trp-).1:λDNA/Hind Ⅲ; 2, 3: Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749, using amyE-11/amyE-22 as primers; 4: examination of cotX-gfp fragment of DRJS749 using primer cotX-a/gfp-b.

图5 重组菌株DRJS749芽胞表面GFP的荧光检测Fig.5 Detection of GFP fluorescence on spore surface of DRJS749.(A, C)Bright-field images of Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749(10×100 oil lens), respectively.(B, D)GFP fluorescence images of Bacillus subtilis 168(trp-)and DRJS749(10 × 100 oil),respectively.

3 讨论

用于芽胞表面展示外源蛋白的载体蛋白必须满足以下条件：位于芽胞衣壳外层的衣壳蛋白；有可融合外源蛋白并暴露于芽胞表面的结构域。枯草芽胞杆菌芽胞由约20余种衣壳蛋白形成的衣壳包裹，已证明cotA、cotB、CotC、CotF和CotG等组成芽胞衣壳的外层。Isticato等[4]利用CotB作为芽胞表面展示外源抗原的载体蛋白，成功地在枯草芽胞杆菌芽胞表面展示了破伤风毒素(TTFC)C末端的 459个氨基酸片段。用芽胞衣壳的另一蛋白成分CotC作为融合载体蛋白，分别将 TTFC和大肠杆菌的不耐热肠毒素 B亚单位(LTB)展示于芽胞表面。Kwon等[6]以CotG为蛋白载体将半乳糖苷酶展示于枯草芽胞杆菌芽胞表面，重组芽胞在水-有机相反应体系中具有半乳糖苷酶催化活性，并且较化学方法固定于芽胞表面的半乳糖苷酶有更好的稳定性。表明位于芽胞衣壳外层的衣壳蛋白CotB、CotC和CotG可用作芽胞表面展示外源蛋白的载体分子。

CotX是枯草芽胞杆菌芽胞的另一种衣壳蛋白[11]，但在芽胞衣壳外层中的准确定位以及其暴露于芽胞衣壳外的结构域还不清楚。本研究以CotX作为载体蛋白，以gfp为报告基因，构建了含重组基因cotX-gfp的重组枯草芽胞杆菌菌株。重组菌株在营养丰富的培养基中能以营养细胞的形式进行增殖，在寡营养培养基或营养不足时，可诱导形成芽胞，并且其他生长特征较亲本菌株无明显的改变。诱导重组菌株产生芽胞，观察到重组芽胞表面具有GFP绿色荧光。表明CotX位于枯草芽胞杆菌芽胞衣壳的外层，其C末端的部分氨基酸暴露于芽胞表面；同时，CotX可作为芽胞表面展示外源蛋白的载体分子，这使芽胞表面展示技术中载体分子有更多的选择余地，尤其在芽胞表面同时展示多种抗原蛋白或多种酶蛋白，制备多价抗原疫苗或复合酶催化系统的重组芽胞，具有重要的应用价值。但CotX作为载体分子将外源蛋白展示于芽胞表面的运载能力，以及展示不同外源蛋白的能力有何差异，有待进一步研究。

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Surface display of GFP using CotX as a molecular vector on Bacillus subtilis spores

Qian Li1,2, Degang Ning1, and Chundu Wu1
1 School of Environment, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China 2 Institute of Life Science, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

Received:September 25, 2009;Accepted:November 16, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of Jiangsu Province(No.BK2006075), Postdoctoral Fund of China(No.20070411025).

Corresponding author:Degang Ning.Tel: +86-511-88797818; E-mail: 306502@ujs.edu.cn江苏省自然科学基金(No.BK2006075), 中国博士后基金(No.2007AA021702)资助。