马宏峰，高丽梅，赵光云，吴立军，高慧媛*

（1.迁西县板栗产业研究发展中心，河北 迁西 064300；2.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016）

质量标准

比色法测定板栗花中总黄酮的含量△

马宏峰1，高丽梅2，赵光云2，吴立军2，高慧媛2*

（1.迁西县板栗产业研究发展中心，河北 迁西 064300；2.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016）

目的：探索板栗花中总黄酮醇提取工艺的最佳条件，并建立板栗花中总黄酮的含量测定方法。方法：以1%AlCl3甲醇溶液为显色剂，山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷为对照品，采用比色法测定。结果：山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷检测浓度在0.008～0.048 mg·mL-1与吸光度呈良好的线性关系，线性回归方程为A＝19.089C＋0.026 3（r＝0.999 8），平均回收率为96.54%，RSD＝0.63%（n＝6），用乙醇提取法提取的板栗花中总黄酮含量达6.92 mg·g-1。结论：本方法简便、快速、准确、重现性好，可用于板栗花中总黄酮的含量测定。

板栗花；山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷；总黄酮；比色法；含量测定

板栗为壳斗科（Fagacaea）栗属（Castanea）植物的落叶果木。板栗花为板栗的雄性花序，其味微苦，涩，性微温，具清热、燥湿、止血、散结的功效。主治泄泻，痢疾，带下，便血等［1］。板栗花中主要含有挥发油、酚酸类、三萜类、甾醇类、生物碱类、黄酮类化合物，而黄酮类化合物具有降脂、降糖、抗血栓、抗氧化等多种生理活性。实验采用L9（34）正交试验设计法，考察了以醇为提取溶剂，醇浓度、溶剂用量、提取时间和提取次数对板栗花中总黄酮提取工艺的影响，确定最佳提取工艺。采用三氯化铝比色法，以山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷为对照品，建立了板栗花中总黄酮的含量测定方法，为其资源的合理开发利用及质量控制提供了理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SHIMADZU UV-1700型紫外可见分光光度计［岛津国际贸易（上海）有限公司］，ESJ 210-4型电子天平（沈阳华腾电子称量仪器有限公司），DZF-150型真空恒温干燥箱（郑州长城科工贸有限公司），DK-98-1型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品（自制，HPLC测定质量分数98%以上）。其余试剂均为分析纯。

1.3 材料

板栗花为2008年6月初采自河北省迁西县，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定为板栗Castanea mollissimaBlume花序。

2 方法与结果

2.1 定量分析方法的建立

2.1.1 板栗花中总黄酮的醇提取工艺考察 采用正交试验法，选取乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素，因素水平见表1。

表1 醇提取工艺因素水平表

称取板栗花粗粉10 g，15倍量石油醚蒸馏脱脂1 h后，按照L9（34）正交表进行试验，提取液合并，过滤，减压回收，干燥，得浸膏，按浸膏质量／药材质量计算浸膏得率。浸膏与聚酰胺（1∶1）拌样，挥干，待上样。量取80 mL聚酰胺，用蒸馏水浸泡1 d，搅拌排除气泡，装入层析柱中，用蒸馏水洗至从柱子里流出来的水清澈为止。上样，分别用水，90%乙醇洗脱10个保留体积，将90%乙醇洗脱液减压回收，干燥后用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，摇匀。精密吸取2 mL置10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 1%三氯化铝（AlCl3）溶液，用甲醇定容至刻度线，放置20 min，以甲醇为随行空白试剂，在399 nm处测定吸光度（A），根据山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷的回归方程计算浸膏中总黄酮的含量。以浸膏得率和浸膏中总黄酮含量进行多指标综合评分。评分时以各指标最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重。本实验中，将浸膏中总黄酮含量的权重系数设为0.7，浸膏得率的权重系数设为0.3，以综合值进行统计分析［1-2］。结果见表2、表3。其中综合评分值Y＝0.3X1×100／32＋0.7X2×100／3.58。

表2 正交设计试验结果

表3 方差分析结果

表2和表3结果表明，在所选的因素水平范围内，各因素对提取效果的影响程度依次为A＞D＞C＞B，即：乙醇浓度＞提取次数＞提取时间＞乙醇用量，各因素的最佳水平为A3B3C3D2。考虑到提取1.5 h与2 h结果差别不大，所以最后选定提取时间为1.5 h，最佳提取工艺为A3B3C2D2，即：20倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次1.5 h。

2.1.2 对照品溶液的配置 精密称取真空干燥至恒重的山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷8.0 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，得浓度为0.16 mg·mL-1的山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取板栗花粗粉10 g，15倍量石油醚脱脂1 h后，用20倍量、70%的乙醇加热回流提取2次，每次1.5 h，提取液合并，过滤，减压回收，干燥，得浸膏2.1 g，与聚酰胺（1∶1）拌样，挥干，待上样。量取80 mL聚酰胺，用蒸馏水浸泡1 d，搅拌排除气泡，装入层析柱中，用蒸馏水洗至从柱子里流出来的水清澈为止。上样，分别用水、90%乙醇洗脱10个保留体积，将90%乙醇洗脱液减压回收，干燥，用甲醇溶解定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.1.4 1%AlCl3甲醇溶液的制备 称取1.00 g AlCl3于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻线，摇匀，静置。

2.1.5 显色剂的选择 精密吸取供试品溶液2份，各0.1 mL，于10 mL容量瓶中。其中一份加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入4%NaOH溶液4 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min。另一份加入1%AlCl3溶液1 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。结果表明，5%NaNO2-10%Al（NO3）3-4%NaOH显色后产生大量沉淀影响含量测定结果，且在紫外可见分光光度200～800 nm进行波长扫描时样品在510nm左右无吸收，见图1。而三氯化铝显色后在405 nm有最大吸收，见图2，故确定1%AlCl3为显色剂。

2.1.6 检测波长的选择 精密吸取对照品溶液1.5 mL，于25 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。以甲醇为随行空白试剂，于紫外可见分光光度200～800 nm进行波长扫描，见图3。结果表明，山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷在399 nm波长处有最大吸收，故确定其为检测波长。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线的制备 分别精密吸取山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品储备液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。以甲醇为随行空白试剂，于399 nm处测定吸光度（A）。以A值为纵坐标，质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算得线性方程A＝19.089C＋0.026 3，r＝0.999 8，结果表明山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷在0.008～0.048 mg·mL－1与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液1.5 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。以甲醇为随行空白试剂，于399 nm处测定吸光度，重复测定5次，计算RSD＝0.91%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取板栗花粗粉5份，各10 g，按2.1.3项下制备样品溶液，精密吸取0.1 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。以甲醇为随行空白试剂，于399 nm处测定吸光度，计算RSD＝0.68%，结果表明重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。分别在0，10，20，30，40，50，60 min时，以甲醇为随行空白试剂，于399 nm处测定吸光度，计算RSD＝0.87%。

2.2.5 加样回收率试验 取6份供试品溶液，各0.05mL，于10mL容量瓶中，分别加入0.16 mg·mL－1对照品溶液0.5，0.5，0.7，0.7，0.9，0.9mL，及1mL 1%AlCl3，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。以甲醇为随行空白试剂，于399 nm处测定吸光度，结果见表4。

2.3 含量测定

取板栗花粗粉3份，各10 g，按2.1.3项下制备样品溶液，精密吸取0.1 mL，于10 mL容量瓶中，加入1 mL 1%AlCl3，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20 min。以甲醇为随行空白试剂，于399 nm处测定吸光度，按回归方程计算药材中总黄酮的含量。结果见表5。

表4 山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷加样回收率

表5 板栗花中中山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷含量测定

3 讨论

本实验以浸膏得率和浸膏中总黄酮含量为指标，在正交工艺考察时，采用综合评分的方法优选板栗花中总黄酮的最佳提取工艺条件。在本实验中，将浸膏得率设为正交因素去考察，因为有效成分的含量是一个重要因素，但浸膏得率也是生产中一个考察的因素，两者应兼顾才行。最后根据各指标在考察中所占的比例进行考察更为合理。

硝酸铝比色法要求物质中含有邻二酚羟基，且邻二酚羟基对位没有取代［3］。文献［4］采用此法对板栗花中黄酮类物质的提取工艺进行了考察，然而，本实验在以芦丁为对照品的硝酸铝比色法进行总黄酮含量测定时发现，只有芦丁在500 nm有吸收峰，而样品溶液无吸收，说明板栗花中的主要黄酮类不具有该显色法所要求的化学基团。因此，以芦丁为对照品的硝酸铝显色法不适合板栗花中总黄酮含量的测定。而具有3-OH或5-OH的黄酮类化合物均可与三氯化铝发生颜色反应，显色范围更广，故本实验选择三氯化铝为显色剂。

板栗花中含大量的黄酮类化合物。黄酮类化合物具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗氧化、抗炎镇痛作用及免疫调节等作用。课题组前期研究结果表明山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷对Hela细胞有很强的抑制作用，而且板栗花中的黄酮类化合物含量远远高于板栗其他部位中的含量，因此对于板栗花的研究与开发具有重要的意义。本文采用AlCl3比色法，以山柰酚-3-O-［6″-O-反式-对-香豆酰基］-β-D-吡喃葡萄糖苷为对照品，对板栗花中总黄酮含量进行了测定，实验方法简便，准确，重现性好，可作为板栗花及相关产品中总黄酮含量测定的一种方法。

［1］Zhang T，Xu L Y，Tao JS，etal.Applying gradingmethods of synthesizing multiple guidelines to optimizing extract technology forRadix Purariae［J］.Chin Tradit Herb Drugs（中草药），2004，35（1）：38-40.

［2］周素琴，赵慧，焦海胜，等.多指标综合评分法优选抗病毒颗粒水提工艺的研究［J］.中成药，2008，30（3）：439-441.

［3］吴雪辉，江南，梁颖诗，等.微波提取板栗花中黄酮类物质的工艺研究［J］.食品工业科技，2006，27（8）：106-109.

［4］刘东平，周亚村，王先荣.罗布麻叶总黄酮的测定方法探讨［J］.时珍国医国药，2007，5（3）：614-616.

《中药资源可持续利用导论》

《中药资源可持续利用导论》由中国医学科学院药用植物研究所陈士林、肖培根教授主编，分为10章，共80万字。本书系统介绍了我国中药资源可持续利用的现状和发展趋势。内容包括中药资源调查、中药区划与产地适宜性分析、中药资源野生抚育与引种驯化、栽培药材生产的可持续发展、中药新资源开发利用，以及中药资源可持续利用模式和战略、濒危中药资源评价与监测等，同时附有研究实例。本书内容丰富，具有较高的学术和实用价值，可供从事中药资源研究及相关产业人员使用参考。

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Content Determination of Total Flavonoids from Flowers of Chinese Chestnut by Colorimetry

Ma Hongfeng1，Gao Limei2，Zhao Guangyun2，Wu Lijun2，Gao Huiyuan2
（1.Qianxi County Chestnut Research＆Development Center，Qianxi Hebei064300，China；2.School of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang Liaoning110016，China）

Objective：To explore the optimal method of extracting total flavones and establish the method for the content determination of total flavonoids in the flowers of Chinese chestnut.Methods：Colorimetry analysis was employed 1%AlCl3worked as colour developing reagent，and kaempferol-3-O-［6″-O-（E）-p-coumaroyl］-β-D-glucopyranoside was used as the reference substance.Results：A good linear relationshi Pwas achieved over the concentration range of0.008～0.048 mg·mL-1for kaempferol-3-O-［6″-O-（E）-p-coumaroyl］-β-D-glucopyranoside with an average recovery of 96.54%，RSD＝0.63%（n＝6）.The equation of linear regression wasA＝19.089C＋0.026 3（r＝0.999 8）.The total flavones in the flowers of chinese chestnut by ethanol extracting could achieve 6.92 mg·g－1.Conclusion：The method was accurate，rapid，accurate and reproducible，and can be used to determine the total flavones in the flowers of Chinese chestnut.

Flowers of chinese chestnut；Kaempferol-3-O-［6″-O-（E）-p-coumaroyl］-β-D-glucopyranoside；Total flavones；Colorimetry；Content determination

河北省科技厅项目——板栗功能产品加工及废弃物综合利用技术研究与示范（09231001D）

*高慧媛，E-mail：gaohuiyuan1997＠yahoo.com.cn

2010-05-18）