姜 辉 吴芙蓉 薛 雪 张家富

肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化发生的前奏和必经的中间环节，研究表明肝纤维化完全有逆转的可能[1，2]。肝乐颗粒为安徽中医学院第一附属医院用于治疗急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化活动期、肝炎病毒携带者的经验方，具有疏肝理脾、活血解毒、兼以扶正利胆退黄之功效，在长期的临床实践中显示出很好的疗效。本研究通过复制CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，观察肝乐颗粒对肝纤维化大鼠纤维化指标的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）药物：肝乐颗粒（安徽中医学院第一附属医院院内制剂）、秋水仙碱（西双版纳版纳药业有限责任公司）。（2）试剂：CCl4（汕头市西陇化工厂）；透明质酸（HA）试剂盒、层粘蛋白（LN）试剂盒、PⅢNP试剂盒、四型胶原（CⅣ）试剂盒、转化生长因子（TGF-β1）试剂盒（北京华英生物技术研究所）；Trizol试剂（Introgen life technologies公司）；逆转录试剂盒、PCR试剂盒（Fermentas公司）。（3）动物：SD 大鼠，雄性，体质量 180 ～220g，由南京医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2008-0004。（4）仪器：8453E紫外分光光度计 （美国安捷伦公司）；电子显微镜XDS-1B（重庆光电仪器总公司）；Hemal 8R冷冻离心机、压缩机制冷式基因扩增仪、GSG2000核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统（珠海黑马医学仪器有限公司）。

1.2 方法 （1）分组及造模：大鼠适应性饲养后随机分为正常组、模型组肝乐颗粒低 （1.5g/kg）、中 （3g/kg）、高 （6g/kg）剂量组和秋水仙碱组 （0.1×10-3g/kg）；每组各10只。除正常对照组外，其余各组分别于大鼠背部皮下注射50％CCl4（0.1mL/100g），正常组给予等量花生油，每周2次，连续12周。第7周，各给药组分别给予相应药物灌胃，每天1次，连续6周。末次给药后，禁食8h处死动物。（2）一般形态学观察：大鼠行动、毛色、饮食、体重等变化情况。（3）血清学指标检测：常规分离血清，放免法测定 HA、LN、PⅢNP、CⅣ、TGF-β1的含量，具体操作按说明书进行。（4）RT-PCR测定肝组织Ⅰ型前胶原mRNA表达：取100mg大鼠肝脏组织，采用Trizol法抽提RNA，总反应体系20μL，42℃水浴1h，合成第一链cDNA。取上述逆转录产物1uL作为反应模板，反应体系为25uL。Ⅰ型前胶原：5-TACAGCACG CTTGTGGATG-3（上 游 ）； 5-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3（下游）。扩增条件为：94℃预变性 5min，94℃变性 40s，51℃ 退火40s，72℃延伸1min，32个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。β - actin：5-TGGAATCCTGTGGCATCCATGA AAC-3（上游 ）；Forward：5-ACGCAGCTC AGTAACAGTCCG-3（下游）。扩增条件为：94℃预变性 5 min，94℃变性 4 0s，51℃ 退火 4 0s，72℃延伸1min，32 个循环，再 7 2℃延伸10 min，4℃保存。以 5 μL PCR 产 物在凝胶上电泳，摄像，存入计算机，并作图像分析。

2 结果

2.1 各组大鼠一般形态学改变情况 造模前，各组大鼠健康状态良好，进食、饮水正常，大便成形，毛色有光泽；造模3～5周后，除正常组外，其余各组大鼠均表现为易激惹，进食量及饮水量明显下降，大便不成形，毛色无光泽，体重下降，符合CCl4造模时的主要体征；给予受试药物后，肝乐颗粒各剂量组进食、活动、毛色、体质量较模型组有明显改善。

2.2 各组大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ含量比较 见表1。与正常组比较，模型组大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，肝乐颗粒低、中、高剂量组肝纤维化大鼠升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平显著降低（P ＜0.05或 0.01）。

2.3 各组血清TGF-β1含量比较 见表1。与正常组比较，模型组大鼠血清TGF-β1水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，肝乐颗粒低、中、高剂量组肝纤维化大鼠TGF-β1水平显著降低（P ＜ 0.05）。

表1 各组血清相关指标比较（ng/mL，±s）

表1 各组血清相关指标比较（ng/mL，±s）

与正常比较，*P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01

组 别正常组模型组肝乐颗粒低剂量组肝乐颗粒中剂量组肝乐颗粒高剂量组秋水仙碱组n 10 10 10 10 10 10 HA 126.23±26.37 219.26±29.09*180.72±45.36△169.56±34.01△△176.61±43.13△172.28±42.35△LN 67.38±15.50 102.46±17.08*80.77±16.32△84.44±20.88△72.19±18.82△△83.24±20.74△PⅢNP 56.69±7.81 84.39±19.75*76.30±13.98 66.96±11.53△△70.08±11.14△69.37±9.77△CIV 71.66±9.08 102.30±13.52*91.09±14.84△83.36±10.30△△88.91±14.88△84.36±10.48△△TGF-β1 8.09±3.13 23.89±6.77*18.60±4.41△19.36±5.19△18.47±4.89△18.67±3.45△

2.4 各组肝组织Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响 见图1。RT-PCR结果分析显示，模型组肝脏Ⅰ型前胶原mRNA的表达显著高于正常组，而肝乐颗粒低、中、高剂量组Ⅰ型前胶原mRNA的表达下降。

图1 各组大鼠肝组织中Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响

3 讨论

目前肝纤维化的血清标志物主要有以下几种。（1）HA：由间质细胞合成，绝大多数存在于组织间隙或结缔组织中，血清HA水平的增高与肝维化的程度呈正相关，可以较好地反映已生成的纤维化程度，是较敏感的反映肝纤维化损害程度的定量指标[3]。（2）LN：为基底膜中特有的非胶原性结构糖蛋白，血清LN值被认为是反应基底膜更新率的指标，可反映窦毛细血管化和汇管区纤维化的范围[4]。（3）PⅢNP：主要在活化的肝星状细胞内合成和释放，肝纤维化时肝星状细胞被激活大量合成PⅢNP。因此，PⅢNP能可靠地反映肝纤维化的活动程度及肝病患者的肝脏组织学改变[5]。（4）CⅣ：为构成基底膜的主要成分，反映基底膜胶原的更新率，CⅣ含量的增高可较灵敏反映出肝纤维化过程，是肝纤维化的早期标志之一[6，7]。本研究结果显示，模型组大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ均明显高于正常组，表示造模成功；与模型组相比，肝乐颗粒各剂量组均能显著降低肝纤维化大鼠升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平，提示肝乐颗粒具有抗肝纤维化作用。

在肝纤维化发展过程中，活化的肝星状细胞是细胞外基质的主要产生细胞，多种细胞因子参与了肝星状细胞的活化，其中TGF-β1是最有效的细胞因子。TGF-β1在肝纤维化过程中的主要作用是激活肝星状细胞，促使细胞外基质产生增加，细胞外基质不仅仅是量的明显增加，同时还伴有质的改变，如窦周的低密度基底膜胶原（Ⅳ、Ⅴ型为主）变为高密度的间质胶原（Ⅰ、Ⅲ型胶原为主）[8，9]。本研究显示，肝乐颗粒能显著降低肝纤维化大鼠血清TGF-β1水平，同时可抑制肝纤维化大鼠肝组织中Ⅰ型前胶原mRNA的表达，提示肝乐颗粒能有效降低细胞外基质的产生，从而发挥抗纤维化的作用。

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