李素杰，周 瑾，王海松，马胜辉，龚明玉(.承德医学院临床医学系007级，河北承德 067000;.承德市中心医院肿瘤外科;.指导教师）

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，在各种恶性肿瘤的死亡顺序中居第二位，每年死亡20多万人，约占世界肝癌死亡人数的一半以上[1]。恶性肿瘤的发生、发展的过程，是细胞的过度增殖和细胞凋亡受到抑制的过程[2]。诱导细胞凋亡已成为治疗肿瘤的一个新热点。应用加热治疗肿瘤早已被临床所接受，但加热对肝癌HepG2细胞凋亡的影响未见报道。为此，我们以肝癌HepG2细胞为模型，观察不同加热时间对肝癌HepG2细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与培养 人肝癌细胞株HepG2:购自南京凯基生物科技有限公司，为单层贴壁生长。培养液为RPMI1640培养基(GIBCO公司产品），内含10%新生牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素。将HepG2细胞置于37℃，5%CO2培养箱内培养至指数生长期进行实验，隔2-3d传代一次，细胞消化液为0.25%的胰酶。

1.2 细胞处理及分组 取生长状态良好的HepG2细胞若干瓶，采用随机对照原则分为对照组和实验组。(1）对照组:即加热0h组(正常培养的HepG2细胞）;(2）实验组:根据加热时间不同分为3组:即加热0.5h组、加热1h组、加热1.5h组。将恒温水浴箱调至所需温度43℃对细胞进行加热，实验组细胞热疗后，弃上清，加入5ml新鲜培养基，置37℃继续培养24h。

1.3 膜联蛋白(Annexin-V-EGFP）流式细胞仪检测 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集上述对照组及不同加热时间处理组细胞(约5×105），PBS洗2遍，1500rpm、4℃、5min收集细胞，弃上清，加入500μl的Bingding Buffer悬浮细胞，加入5μl Annexin-V-EGFP及5μlPI混匀后，室温避光反应15min，采用流式细胞仪检测心肌细胞膜PS外翻的情况， 用Muticycle软件分析计算凋亡心肌细胞的百分比。……