王 琳，朱 缨

(苏州卫生职业技术学院，江苏 苏州 215009)

叶下珠 Phyllanthus urinaria L.为大戟科叶下珠属植物叶下珠的干燥全草，又名珍珠草、夜合草、阴阳草，主要分布于长江流域和南方诸省[1]。该药具有清热、解毒、明目等功效，是一种传统的中草药。叶下珠具有明显的抗乙型肝炎病毒(HBV)、保护肝损伤等药理作用，是一种尚未开发利用但很有价值的药用资源，黄酮为其抗病毒有效成分之一[2]。笔者以槲皮素作为叶下珠中黄酮类成分的代表，采用高效液相色谱法测定不同生长期叶下珠中槲皮素的含量，为正确选择叶下珠药材的采收期提供科学依据，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(包括G1311A型四元泵，G1315B型DAD检测器，G1322型在线脱气机，7725i型手动进样器);Agilent HPLC系统化学工作站;CP225D型Sartorius电子天平。槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号为100081-200406);叶下珠药材是本课题组成员在本院药用植物园中种植的，经本院朱缨副教授鉴定均为大戟科叶下珠属植物叶下珠 Phyllanthus urinaria L.;乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:Zorbax SB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm);流动相:乙腈 -0.2%磷酸(30 ∶70);进样量:20 μL;流速:1 mL/min;检测波长:370 nm;柱温:30℃。在此色谱条件下，叶下珠中槲皮素达到基线分离，且其他组分色谱峰不干扰测定(图1)。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称定干燥至恒重的槲皮素对照品5.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为0.05 g/L的槲皮素对照品溶液。取叶下珠粗粉约15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇147 mL，再精密加入浓盐酸3 mL，称定质量，加热回流提取2 h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 mL置10 mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系列对照品溶液。取上述对照品溶液，分别进样20 μL，以槲皮素峰面积值(Y)与含量(X)进行回归，得回归方程 Y=823.78X+1.974，r=0.9999(n=6)。结果表明，槲皮素进样量在 0.05 ～0.40 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取质量浓度为0.012 g/L的槲皮素对照品溶液，重复进样6次。结果峰面积平均值为195.2，RSD为2.14%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:分别取2008年9月采收的叶下珠药材粗粉6份，按溶液制备方法操作，制备6份供试品溶液，依法测定。结果峰面积平均值为106.5，平均含量0.127 mg/g，RSD为1.2%(n=6)，表明本方法重复性良好。

稳定性试验:取2008年9月采收的叶下珠药材，按溶液制备方法操作，制备 1 份供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，10 h 时测定峰面积。结果峰面积平均值为104.7，RSD为2.42%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

加样回收试验:取已知含量(0.127 mg/g)的叶下珠粉末6份，每份约7.5 g，精密称定，分别加入质量浓度为0.954 g/L的槲皮素对照品溶液1 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，在上述色谱条件下进样20 μL，测定峰面积。结果见表1。

表1 槲皮素加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

将2009年6月至10月采收的叶下珠药材按上述方法制备供试品溶液，取供试品溶液与对照品溶液各20 μL，测定叶下珠中的槲皮素含量。结果见表2。

表2 叶下珠中槲皮素含量测定结果(n=5)

3 讨论

曾分别采用100%甲醇+浓酸，75%甲醇+浓酸，50%甲醇+浓酸回流提取和超声波法提取[3]，结果第1种方法和第4种方法中槲皮素提取率低，第3种方法杂质较多、难分离，只有第2种方法中槲皮素提取率高且易于分离。

为了找到最合适的检测波长，曾用DAD检测器对槲皮素对照品溶液进行了全波长扫描，通过分析扫描图发现，在370 nm波长处，槲皮素吸收峰的峰形较好，吸光度较大，故选择370 nm作为检测波长，吸光度最低的285 nm作为参比波长。

试验中曾选用甲醇-0.4%磷酸[4]、甲醇-乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液作为流动相，结果发现甲醇会使槲皮素形成前沿峰，影响检测结果，故选择了最后一种流动相条件。在流动相中加入一定量的磷酸是为了改善峰形和分离度，但为了增加柱的稳定性和使用寿命，应在保证分离度的情况下将磷酸的用量控制在最低。

叶下珠药材中槲皮素含量随着生长期的延长而不断增高，在地上部分枯萎前含量最高。因此，叶下珠的最佳采收期应为9月至10月。

[1]吴克芹，吴克霞，李俊婕.抗乙肝植物药叶下珠的研究进展[J].齐鲁药事，2008，27(10):612.

[2]贺浪冲，岐 林，吕居娴，等.陕西叶下珠药用开发研究Ⅲ:叶下珠提取物体外灭活HBV抗原作用[J].西北药学杂志，1996，11(1):11.

[3]王树松，刘风云.不同生长期柿叶总黄酮和槲皮素的含量测定[J].中国药业，2007，16(9):22.

[4]缪亚东，欧阳臻，袁 斌.高效液相色谱法测定野马追药材中槲皮素和山柰素含量[J].中国药业，2008，18(10):20.