邓 红，田芸芸，田子卿，仇农学，郭玉蓉

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062)

响应曲面法优化文冠果种仁蛋白的碱溶酸沉提取工艺

邓 红，田芸芸，田子卿，仇农学，郭玉蓉

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062)

以文冠果种仁脱脂粉为原料，采用碱溶酸沉法提取文冠果蛋白，利用响应曲面法优化其提取工艺。运用Box－Behnken实验设计方法，在单因素实验的基础上，以蛋白质得率为实验指标，研究液料比、pH、提取时间以及提取温度等影响因素及其交互作用对蛋白质得率的影响。实验结果表明，文冠果蛋白质碱溶酸沉的最佳提取工艺参数为:液料比11∶1(mL/g)，pH11，提取时间73min，提取温度41℃。在本实验范围内各影响因素对蛋白质提取率作用的大小依次为:pH＞液料比＞时间＞温度。在此条件下，蛋白质提取率达到83.58%，利用响应面分析法得到的二次多项式回归方程数学模型Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2能较准确地预测实验结果。

文冠果，蛋白质，提取

Abstract:The Xanthoceras sorbifolia bunge kernel protein was extracted by Alkali－Solution and Acid－Isolation.The extraction processing was optimized through response surface analysis.By use of the Box－Behnken experimental design method，the effects of the ratio of liquid，pH，extraction time and temperature and their interactions on the protein yield were studied on the base of the single－factor test.The test results showed that the optimum conditions of alkali－solution and acid－isolation extraction for Xanthoceras sorbifolia bunge protein were as following:the ratio of liquid 11∶1(mL/g)，pH11，extraction time 73min，extraction temperature 41℃.The influence order of factors to protein extracting rate is pH＞ratio between solid and liquid＞reaction time＞reaction temperature.Under these conditions，the rate of protein extraction reached 83.58%.The mathematic model of the quadratic polynomial regression equation was obtained through the method of response surface analysis which could predict the yield of protein exactly.

Key words:Xanthoceras sorbiflia bunge;protein;extraction

文冠果(Xanthoceras sorbifoLia Bunge)为无患子科文冠果属落叶乔木或大灌木，是中国特有的珍稀木本油料树种，也是中国北方地区很有发展前途的水土保持树种和珍稀观赏树木［1－3］。文冠果种仁既含有大量的油脂，又含有丰富的植物蛋白质，据分析其种仁含油脂58.91%，有14种脂肪酸，不饱和脂肪酸含量高达94%;种仁含蛋白25.75%，有17种氨基酸，必需氨基酸种类齐全，且氨基酸评分较高，具有很高的营养价值［4－6］。蛋白质由于种类多、性质差异大，因而提取与制备方法也很多。由于大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中，所以可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。目前，油料蛋白质的提取主要有反胶束溶液萃取、等电点沉淀、离子交换、碱溶酸沉、膜分离等方法［7－9］，其中碱溶酸沉法是我国普遍采用的生产工艺，此法能够有效地提高产品得率，充分利用蛋白资源。目前关于文冠果种仁蛋白提取的报道较少，本实验以文冠果种仁脱脂粉为原料，采用响应面分析法优化文冠果蛋白质碱溶酸沉的工艺条件，探讨液料比、pH、时间和温度等因素对文冠果蛋白质得率的影响，确定最佳工艺参数，为深入开发利用文冠果蛋白质资源提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

文冠果籽 购于陕西志丹，挑选完整、饱满、无虫害的文冠果籽作为实验原料，手工去壳，种仁粉碎，过40目后冷榨取油，渣饼脱脂后粉碎冷藏备用。95%乙醇 分析纯，西安三浦精细化工厂;氢氧化钠

分析纯，天津市化学试剂三厂;石油醚 30～60℃，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司;无水硫酸钠、氢氧化钾 分析纯，天津市河东区红岩试剂厂;盐酸 分析纯，天津市津北精细化工有限公司;酚酞

分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。

KDY－9810型凯氏定氮仪 北京市通润机电有限公司;121MB型氨基酸自动分析仪 美国贝克曼(Beckman)公司;超速粉碎机 天津市达康电器公司;真空冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;PHS－3C精密pH计、JA2003N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;DF－101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂;722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 文冠果蛋白的制备

1.2.1.1 原料预处理 将文冠果仁渣饼粉碎，45℃下用石油醚(30～60℃)脱脂四次，置通风厨中12h以挥发溶剂，得脱脂粉，于冰箱4℃保存备用。脱脂文冠果粉中蛋白质含量测定采用半微量凯氏定氮法。

1.2.1.2 工艺流程 文冠果脱脂粉→碱溶、浸提→离心→等电点沉淀→洗涤→冷冻干燥→文冠果蛋白粉

1.2.1.3 文冠果蛋白的提取步骤［10－12］取一定量脱脂粉与双蒸水按一定料液比混合，用1mol/L NaOH调至一定pH，于一定温度下磁力搅拌器搅拌浸提30min，然后在4℃下以4000r/min离心20min。沉淀物再重复提取1次，合并2次上清液，用1mol/L HCl调pH至等电点以沉淀蛋白质，经静置沉淀后，以双蒸水洗涤沉淀3次，再用1mol/L NaOH回调pH至7.0，搅拌使沉淀复溶后真空冷冻干燥，即为文冠果蛋白粉。

1.2.2 碱溶酸沉单因素实验

1.2.2.1 液料比的确定 分别设定液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)，50℃，pH 为 10 下浸提80min，研究液料比对蛋白质得率的影响，确定最佳的液料比。

1.2.2.2 pH的确定 液料比10∶1，分别选择pH为8、9、10、11、12，其他实验条件同 1.2.2.1，确定最佳的pH。

1.2.2.3 提取时间的确定 液料比10∶1，pH为10，分别选择浸提时间为 40、60、80、100、120min，其他实验条件同1.2.2.1，确定最佳提取时间。

1.2.2.4 提取温度的确定 液料比10∶1，pH为10，浸提时间60min，分别选择提取温度为 30、40、50、60、70℃，研究提取温度对蛋白质得率的影响，确定最佳提取温度。

1.2.3 碱溶酸沉工艺优化实验 结合单因素实验结果，采用Box－Behnken进行实验设计，选取液料比(mL/g)、pH、提取时间(min)及提取温度(℃)为影响因素，采用四因素三水平的响应面法进行实验，利用Design－Expert7.1.6软件进行数据处理和回归分析。分别用A、B、C、D来表示4个影响因素，并以+1、0、－1分别代表变量的水平，蛋白质得率为响应值(即实验指标)，实验设计方案［13－15］见表 1。

表1 Box－Behnken方案设计的中心组合实验因素和水平编码表

1.3 分析方法

1.3.1 文冠果粗蛋白含量测定 粗蛋白按GB/5511－1985 方法进行［16－17］(即凯氏定氮法)。

1.3.2 文冠果水溶性蛋白含量测定 水溶性蛋白:采用考马斯亮蓝法［16］。以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，绘制蛋白质标准曲线，建立回归方程为A=0.0007C+0.0069，其中A为吸光度，C为蛋白质浓度(mg/mL)，R2=0.9995。

图1 蛋白含量测定标准曲线

1.3.3 文冠果蛋白提取率计算

文冠果蛋白提取率(%)［6］=提取液中蛋白质含量/脱脂粉总蛋白含量×100%

注:提取液中蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法;脱脂粉中蛋白质含量测定方法为半微量凯氏定氮法。

2 结果与讨论

2.1 文冠果种仁粗蛋白含量分析

采用凯氏定氮法分析了陕西志丹产地的文冠果种仁粗蛋白含量，其值为22.40%。脱脂粉经碱溶酸沉、真空冻干后可获得较纯蛋白，经半微量凯氏定氮法测定其含氮量为6.5642%，蛋白质含量为82.06%。

2.2 蛋白质提取单因素实验结果

2.2.1 液料比对蛋白质提取率的影响 按照1.2.2.1方法进行实验，液料比对蛋白质提取率的影响实验结果如图2所示。

由图2可知，随着液料比的增大，蛋白质的提取率随之升高。当液料比较小时，蛋白质提取率较低，可能由于文冠果中含有一定量的淀粉和纤维，具有较强的吸水膨胀能力，使物料流动性差难以搅拌，导致蛋白质提取率低。液料比大于10∶1(mL/g)时，蛋白提取率增加值已不明显。所以液料比取10∶1(mL/g)较佳。

图2 液料比对蛋白质提取率的影响

2.2.2 pH对蛋白质提取率的影响 按照1.2.2.2方法进行实验，pH对蛋白质提取率的影响实验结果如图3所示。

图3 pH对蛋白质提取率的影响

由图3可知，随着pH的升高，蛋白质提取率增加，且在pH等于10时提取率达最大值。pH大于10，则蛋白质提取率下降，pH太高可能会引起蛋白质变性，使得提取率有所降低。所以最佳提取pH为10。

2.2.3 提取时间对蛋白质提取率的影响 按照1.2.2.3方法进行实验，提取时间对蛋白质提取率的影响实验结果如图4所示。

图4 提取时间对蛋白质提取率的影响

由图4可知，在时间小于60min时，曲线显著上升，60min到达峰值，之后有明显下降的趋势。蛋白质溶出率越高，蛋白质提取率越高。当浸提时间达到60min时，蛋白质的溶出率达到动态平衡。所以蛋白质提取时间为60min较佳。

2.2.4 提取温度对蛋白质提取率的影响 按照1.2.2.4方法进行实验，提取温度对蛋白质提取率的影响实验结果如图5所示。

由图5可知，温度的高低对文冠果蛋白质溶解度有较大的影响。随着温度的升高，蛋白质提取率增大。当温度达到50℃时提取率达到最大，之后显著降低。可能是因为蛋白质在50～60℃易受热变性，使蛋白质提取率下降。所以最佳提取温度为50℃。

图5 提取温度对蛋白质提取率的影响

2.3 碱溶酸沉提取工艺的优化

2.3.1 实验结果 采用四因素三水平的响应面法进行碱溶酸沉提取工艺的优化，按照1.2.3的方法实验，结果见表2。

表2 Box－Behnken方案设计及响应面法实验结果

2.3.2 模型的建立及其显著性检验 利用Design－Expert7.1.6软件对表2实验数据进行多元回归拟合，得到文冠果蛋白质得率对液料比(A)、pH(B)、提取时间(C)及提取温度(D)的二次多项回归模型为:

Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C－0.49D－0.22AB－2.57AC+1.05AD+5.11BC+1.70BD+2.57CD－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2

对该模型进行显著性检验，结果见表3，回归模型系数显著性结果见表4。

由表3方差分析结果可以看出，模型Model P=0.0004，模型达到显著。失拟项Lack of Fit P=0.1950＞0.05不显著，因此二次模型成立，应用此模型可以分析和预测蛋白质碱溶酸沉提取工艺的优化。

表3 回归模型的方差分析结果

表4 回归模型系数的显著性检验结果

由表4回归模型系数显著性检验结果可知，模型的一次项 A、B、C均显著，D不显著，二次项均显著，交互项BC显著，其他交互项均不显著。影响蛋白质提取率的因素依次为B＞A＞C＞D，即pH＞液料比＞时间＞温度。

剔除不显著项后的数学模型为:

Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2

2.3.3 文冠果蛋白质碱溶酸沉提取工艺的响应面分析与优化 根据回归模型做出相应的响应曲面图见图 6～图11。

图6 液料比与pH的交互作用影响的响应曲面和等高线

由图6～图11可知，液料比与pH之间的交互作用、液料比与提取时间之间的交互作用、液料比与提取温度之间的交互作用、提取时间与提取温度之间的交互作用、pH与提取温度之间的交互作用均不显著，仅有pH与提取时间之间的交互作用显著。

2.3.4 提取条件的优化［18－19］通过专业软件分析，碱溶酸沉提取文冠果种仁蛋白质的最佳工艺条件如表5所示。

图7 液料比与提取时间的交互作用影响的响应曲面和等高线

图8 液料比与提取温度的交互作用影响的响应曲面和等高线

图9 pH与提取时间的交互作用影响的响应曲面和等高线

图10 提取时间与温度的交互作用影响的响应曲面和等高线

图11 提取温度与pH的交互作用影响的响应曲面和等高线

表5 提取率最佳的各个因素组合

由表5可知，文冠果蛋白的最佳提取工艺参数为:液料比10.59∶1(mL/g)，pH10.6，时间 73.4min，温度41℃，在此条件下，蛋白质提取率理论值为84.66%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行文冠果蛋白质提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为:液料比11∶1(mL/g)，pH11，时间 73min，温度 41℃。在此条件下提取，实际测得的平均得率为83.58%，与理论值较接近，因此，基于响应面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，进一步验证了数学回归模型的合适性。

3 结论

3.1 本实验在研究碱溶酸沉法提取文冠果蛋白质时各因素对提取率的影响的基础上，采用了响应面分析法对蛋白质提取工艺进行优化。

3.2 响应面法优化碱溶酸沉提取文冠果蛋白的最佳工艺条件为:液料比 11∶1(mL/g)，pH11，时间 73min，温度 41℃，在此条件下，文冠果蛋白质得率可达84.66%。

3.3 在本实验范围内，各影响因素对蛋白质提取率作用的大小依次为:pH＞液料比＞时间＞温度。

3.3 利用响应面分析法得到的二次多项式回归方程数学模型Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2，能较准确地预测实验结果。

［1］高启明，侯江涛，李阳.文冠果的栽培利用及开发前景［J］.中国林副特产，2005，75(4):56－57.

［2］高述民，马凯，杜希华，等.文冠果研究进展［J］.植物学通报，2002(3):296－301.

［3］李占林，李铣，张鹏.文冠果化学成分及药理作用研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2004，21(6):472－475.

［4］王红斗.文冠果的化学成分及综合利用研究进展［J］.中国野生植物资源，1998(1):13－16.

［5］黄玉广，乔荣群，赵军.文冠果营养及综合加工［J］.食品研究与开发，2004，25(3):73－76.

［6］鲍纯义，于守洋.脱脂文冠果种仁蛋白的营养学研究［J］.中国公共卫生报，1989(1):129－132.

［7］张寒俊.碱溶酸沉法制备双低菜子分离蛋白的工艺探讨［J］.农产品加工，2005，38(5):40－43.

［8］鲁子贤.蛋白质和酶学研究方法［M］.北京:科学出版社，1988.

［9］刘宁，朱振宝，等.苦杏仁蛋白提取工艺优化及氨基酸分析［J］.中国油脂，2008(1):26－29.

［10］邓红，孙俊，范雪层，等.文冠果籽油的不同提取工艺及其组成成分比较［J］.东北林业大学学报，2007，35(10):39－40.

［11］李招娣，邓红，范雪层，等.冷榨文冠果籽油的氧化稳定性研究［J］.中国油脂，2008，33(9):34－35.

［12］邓红，何玲，孙俊.文冠果油的冷榨提取及理化性质研究［J］.西南农业大学学报:自然科学版，2006，28(6):1028－1031.

［13］胡纱纱，汪一红，陈娟娟，等.响应面法优化黄连木多糖酸提取工艺的研究［J］.食品工程，2009(1):104－108.

［14］邹鲤岭，李昌盛.响应面法优化米糠蛋白提取工艺［J］.粮食与饲料工业，2008(10):22－23.

［15］Sugarman N.Process for extraction of oiL and protein simuLtaneousLy from oiL － bearing materiaL ［P］.US Patent，2762820，1956.

［16］无锡轻工学院.食品分析［M］.北京:中国轻工业出版社，1993.

［17］刘魁英.食品研究与数据分析［M］.北京:中国轻工业出版社，2005:213－229.

［18］张鸣镝，王章存.响应面分析法优化玉米胚芽蛋白的提取工艺研究［J］.农产品加工，2008，142(7):174－177.

［19］ABD EL－AAL M H，HAMZA M A.Invitro digestibiLity，physic－chemicaL and funditionaL properties of apricot kerneL proteins［J］.Food Chemistry，1986(19):197－211.

Study on the optimization of extraction processing for Xanthoceras sorbifoLia bunge kernel protein by alkali－solution and acid－isolation

DENG Hong，TIAN Yun－yun，TIAN Zi－qing，QIU Nong－xue，GUO Yu－rong
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

TS201.2+1

B

1002－0306(2010)08－0197－05?

2009－07－01

邓红(1945－)，女，副教授，硕士生导师，主要从事食品分离技术研究。

农业部公益性项目(nyhyzx07－024);农业部苹果产业体系(nycytx－08)项目资助。