武鑫,刘金龙,李生泉

(1.山西农业大学文理学院,山西 太谷030801;2.山西农业大学 现代教育技术学院,山西太谷 030801)

现代分子生物学的发展及分子生物学在临床诊断中的应用,已证明许多疾病的发生,尤其是目前困扰人类的癌症等都与体内的遗传物质-DNA的变化有着密切的关系[1],所以定量测定是诠释其结构和功能的基础。目前,测定DNA的方法有分光光度法[2],荧光分析法[3～5],电化学发光法[6]及电化学法[7]等。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、操作方便等优点,在生物分析中已有广泛的应用。但DNA本身的荧光很弱,直接运用其荧光发射来研究它的结构和生物活性受到限制,必须引入荧光探针[8]。

许多染料探针可以和DNA发生强烈的相互作用,是一类可以利用的DNA探针。染料刚果红(CR)与DNA作用方面虽有人做过研究[9～10],但侧重于对 DNA作用方式的研究,而对于DNA含量的分析测试研究甚少。实验研究了CR与DNA反应的基本条件,建立了以CR测定DNA的荧光光度分析法及相应的研究体系。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

970 CRT荧光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);雷磁p HS-2C型酸度计,超声波清洗机。

ctDNA(中国科学院北京百泰生化技术公司):配成1.0×10-4g·mL-1的标准液,冰箱中4℃保存备用;羊驼血液DNA浓缩液,由山西农业大学动物科技学院提供;CR储备液(1.0×10-3mol·L-1):使用时稀释为1.0×10-4mol·L-1的工作液;0.1 mol·L-1的 Tris-HCl缓冲液(p H=7.4);CTMAB:1.0×10-3mol·L-1;实验所用其它试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

在22～25℃下,向25 mL容量瓶中依次加入1.0 mL pH=7.4的 Tris-HCl缓冲溶液,2.0 mL 1.0×10-4mol·L-1的CR工作液,0.8 mL 1.0×10-3mol·L-1的CTMAB及不同体积的ctDNA溶液,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,充分振荡,室温静置40 min,测定F325/613nm,不加ctDNA,按上述步骤做空白试验,测定荧光强度F0值。令ΔF=FF0,以ΔF作为测定ctDNA的信号响应值。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱特征

图1为体系的荧光光谱。由图可知,CR本身在613 nm处有弱的荧光峰,当CTMAB加入时CR荧光强度有所增强,而当ctDNA再加入时荧光强度大了很多,表明CR、CTMAB和ctDNA三者发生了相互作用,形成了大的聚集体,使体系的荧光强度大大增强。因此随后的实验中我们选择λem=613 nm作为工作波长。

2.2 反应条件

2.2.1 pH的影响

实验考察了pH 4～10范围内体系的荧光强度。结果如图2所示,在pH 7～8范围内体系的ΔF值较大且稳定。本实验选用0.1 mol·L-1的Tris-HCl缓冲液(p H 7.4)1 mL。

图 1 体系的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of system

图2 p H对△F的影响Fig.2 Effect of p H

2.2.2 CR的用量

固定pH为7.4的Tris-HCl 1.0 mL,ctDNA的浓度为1.0×10-6g·mL-1,考察了CR的浓度在4.0×10-7～4.0×10-5mol·L-1范围内对体系荧光强度的影响。图3表明,当浓度为8.0×10-6mol·L-1时体系的ΔF值最大,当浓度再加大时体系的ΔF值随浓度的增加而显著降低,本实验选择CR的浓度为8.0×10-6mol·L-1。

图3 刚果红浓度ΔF的影响Fig.3 Effect of CR concentration

2.2.3 CTMAB的用量

CTMAB对CR与ctDNA结合后的荧光强度有增强作用。图4表明,CTMAB的浓度较小时,体系的ΔF值随CTMAB浓度的增加而增加,在3.2×10-5mol·L-1时 ΔF值达到最大,CTMAB浓度再增大时,体系的 ΔF值下降,本实验选择CTMAB的浓度为3.2×10-5mol·L-1。

图4 CTMAB浓度对ΔF的影响Fig.4 Effect of CTMAB concentration

2.2.4 试剂的添加顺序

本实验对试剂的添加顺序做了研究(见表1)。结果显示,先将Tris-HCl缓冲溶液与CR混合,再加入表面活性剂CTMAB和ctDNA效果最好,这是因为缓冲溶液为CR与CTMAB和ctDNA的结合提供了适宜的p H环境,所以能产生较强的荧光强度。本实验选择试剂的添加顺序为Tris-CRCTMAB-ctDNA。

表1 试剂添加顺序对体系ΔF的影响Table 1 Effect of order of adding reagents

2.2.5 离子强度

ctDNA的双链之间因磷酸基团带负电荷而产生静电斥力。实验表明,在固定体积下,随着NaCl浓度的增大,体系的荧光强度有所减弱,但其变化值不大(见图5)。这是因为体系中存在NaCl时,随着钠离子浓度的增加,减小了负电性DNA磷酸骨架间的势电斥力,使DNA链变紧,有机分子不易嵌入DNA碱基对间的结合位点,而被排斥游离在溶液中。所以随着溶液中NaCl浓度的增加影响了DNA的存在状态,从而影响了CR与DNA的相互作用,释放了部分原来可以与DNA结合的CR,从而使该体系的荧光强度减弱,而变化值不大是因为NaCl对DNA的作用是有限的,它只能在一定程度上使DNA链变紧,所以随着NaCl浓度的进一步增加不能导致更多的CR释放出来,该体系的荧光强度逐渐趋于稳定。

图5 离子强度对体系F的影响Fig.5 Effect of ion strength

2.2.6 干扰离子

实验还考察了常见金属离子等对测定的干扰情况。表2表明:金属离子在较高的浓度下(相对ctDNA的浓度而言)对测定体系的ΔF值影响较小。

表2 干扰离子的影响Table2 Effect of interfering ions

2.3 工作曲线

优化实验条件下,ctDNA的浓度在0.005～3.60 mg·L-1范围内时,荧光的增强程度与ctDNA浓度呈线性关系,回归方程为:ΔF=131.22c+3.854 3(c:mg·L-1),r=0.9988,根据空白的平均值加上3倍的空白标准偏差即为检出限,可求得检出限为0.01 mg·L-1。

2.4 样品的测定

本体系对羊驼血液中DNA的测定,测定的平均RSD为2.4%,并同紫外分光光度法测定进行了比较,结果同一个样品用两种方法测定的结果分别为0.594 mg·L-1和0.500 mg·L-1,这表明本方法有较好的准确度。在实际样品测定时,ctDNA加入回收率为96.25%～102.50%(见表3)。

3 结论与讨论

本实验首次采用刚果红做荧光探针利用荧光光度法建立了一种测定ctDNA的新体系:CR-CTMAB-ctDNA,并将本方法首次成功地应用于羊驼血液中DNA的测定,结果令人满意。

表3 实际样品中ctDNA加入的回收率Table3 Recovery of ctDNA in real samples

测定ctDNA含量的方法很多,但荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、操作方便等优点,在生物分析中应用广泛。本实验中选用的荧光探针CR是价廉、易得的,并且从实验中得到的相关系数、检出限和回收试验等数据说明该方法准确、可靠,所以本实验方法是可推行的。对 CR、CTMAB与ctDNA之间的相互作用方式还有待进一步研究。

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