颜亚晖 蒋海鹰周 庆

(中南大学基础医学院病理学系 湖南长沙410078)

石蜡包埋前组织去黑色素法探讨

颜亚晖 蒋海鹰＊周 庆

(中南大学基础医学院病理学系 湖南长沙410078)

去黑色素;过氧化氢

在研究含有黑色素的肿瘤时,其组织石蜡切片HE染色如未经去色素处理,显微镜下可见大量浓密的黑色素颗粒,遮盖组织结构无法正常观察,作出正确判断,必须进行去黑色素处理。传统的去黑色素方法是在石蜡切片上进行脱色素反应,常用脱色剂为高锰酸钾或过氧化氢,二者均为强氧化剂,在去除黑色素的同时,极易使组织片脱落,尤其在进行免疫组化染色时脱片更为严重。为解决上述问题,我们将含有黑色素的组织,经固定后先直接去除黑色素,再常规处理,制作石蜡切片,获得满意效果,现介绍如下。

材料和方法

1.材料 收集我院2008-2009年手术眼球标本6例。

2.试剂 过氧化氢(市场出售,其浓度为30%),按5%,10%,20%,30%四种浓度配制备用。

3.方法 ①将组织用10%福尔马林充分固定;②每例标本切取2mm组织厚片分别置入 5%, 10%,20%,30%过氧化氢液中,置37℃温箱进行脱色素反应;③定期用解剖显微镜观察色素去除情况,每10h更换一次相同浓度的过氧化氢液体,当镜下未见棕褐色颗粒时即取出组织用自来水洗涤终止反应;④以10%福尔马林补充固定组织1h;⑤组织按常规处理,石蜡切片;⑥分别进行HE染色和免疫组化染色(CD34、VEGF)。

图1去色素后的脉络膜组织,HE染色 ×100;图2含有大量色素的脉络膜组织 ,HE染色 ×200;图3去色素后的脉络膜组织,Elivision法VEGF×100;图4去色素后的脉络膜组织,Elivision法VEGF×200Fig.1 Tela chorioidea after depigment.HE staining ×100;Fig.2 Tela chorioidea containing pigment.HE staining× 200;Fig.3 Tela chorioidea after depigment.Elivision method(VEGF), ×100;Fig.4 Tela chorioidea afterdepigment.Elivision method(VEGF),×200

结 果

1.能够完全去除组织中的黑色素,HE染色组织结构清晰,无脱片现象(图1);未经去色素处理,组织石蜡制片 HE染色可见大量色素(图2);去色素处理后免疫组化染色CD34、VEGF阳性表达定位准确、清晰,无脱片现象,无背景染色(图3、4)。

2.4 种浓度过氧化氢去黑色素的效果与反应时间有较明显差异(见表),经比较20%过氧化氢去色素效果好结构完整且易控制。

表 4种浓度过氧化氢去黑色素反应时间与效果比较Table Depigment effects and reaction time of 4 kinds of hydrogen peroxide concentration

讨 论

黑色素是由色素细胞形成的不含硫的色素,经过氧化剂的氧化打开黑色素的酚环使之脱色[1]。用来去除黑色素的方法较多,但常用高锰酸钾和过氧化氢两种氧化剂,并采取传统的在组织石蜡切片上进行脱色素反应的方式。尽管使用防脱片处理的载玻片,在临床常规病理HE染色中脱片现象有所改观;但在免疫组化染色中切片经高温或高压进行抗原修复,仍然存在严重脱片现象,且使用过氧化氢脱片更甚于高锰酸钾[2]。有文献报导,在免疫组化染色中,高锰酸钾/草酸脱色素法会使某些抗原的特异性或敏感性发生改变[3-4],导致染色结果出现假阳性或假阴性[5-6];若增高高锰酸钾浓度以求良好的脱色素效果,则出现细胞形态破坏及组织丢失[7],而过氧化氢对大部分抗原均适用[3.4]。因此,选择适宜浓度的过氧化氢直接对组织进行去色素反应,再按常规制备石蜡切片,既可解决脱片问题,且去色素效果良好;HE染色未见细胞形态破坏,组织丢失现象;免疫组化染色也可避免假性结果。同时,因为常规免疫组化染色必须用过氧化氢封闭组织内源性过氧化物酶,按上述方法去色素后不但可省去此操作步骤,而且免疫组化染色无背景显示,阳性表达更清晰。

值得注意,过氧化氢是一种强氧化剂,且具有腐蚀作用。首先,在去色素反应时,其浓度的选择、反应时间的控制均应严格掌握。浓度过高、时间过长,可造成组织损伤并破坏细胞结构的完整性;浓度过低则耗时,去色素不彻底,影响染色和观察;反应过程需在解剖显微镜下观察控制,一达到要求及时终止反应并彻底洗涤。其次,组织去色素前必须用福尔马林充分固定,增强组织细胞抗氧化、抗腐蚀的能力,以免破坏细胞结构,且脱色素反应后再补充固定,保证组织结构的完整。最后,过氧化氢不稳定,容易分解,金属离子、光等可加速其分解,在组织去色素时,应选择玻璃容器和避光反应,还需定期更换试剂以保证过氧化氢浓度。经反复实验和比较,选择20%过氧化氢,37℃温箱反应36-40h,期间多次更换试剂,可获得满意结果。

[1]范慧,李百彦,邹烨,等.两种快速脱黑色素的方法.临床与实验病理学杂志,2007,23(6):723

[2]王凤华,李彬,李辽青,等.脉络膜黑色素瘤脱色素处理后FⅧ-Rag、VEGF的免疫组化染色.中国实用眼科杂志,2003,21(5):388-390

[3]McGovern Crocker J,et al.The effect of melanin pigment removal on the perosidase antiperoxidase technique.Am J pathol,1987,88:480-483

[4]Orchard GE,et al.Heavily pigmented melanocytic neoplasma:comparison oftwo melanin bleaching techniques and subsequent immunohistochemical staining.Br J Biomed Sci,1999,56(3):188-193

[5] Foss AJ,Alesander RA,Jeffereies,LW,et al.Immunohistochemical techniques:the effect of melanin bleaching.Br J Biomed Sci,1995,52(1):22-25

[6]Orchard GE,Calonje E,et al.The effect of melanin bleaching on immunohistochemical staining in heavily pigmented melanocytic neoplasms.Am J Dermatopathol, 1998,20(4)357-361

[7]Kligora CJ,Fair KP,Clem MS,et al.A comparison of melanin bleaching and azure blue counterstaining in the immunohistochemical diagnosis ofmalignantmelanoma.Mod Pathol,1999,12(12):1143-1147

Q4-33

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.023

2010-03-01

2010-04-20

颜亚晖,女(1971年),汉族,实验师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)