宋 楠 杨晓凤

(解放军四六三医院细胞治疗中心,辽宁沈阳110042)

假肥大型肌营养不良肌细胞抗肌萎缩蛋白的免疫组化研究

宋 楠 杨晓凤＊

(解放军四六三医院细胞治疗中心,辽宁沈阳110042)

目的 研究假肥大型肌营养不良患者肌细胞中抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的表达及其诊断意义。方法 应用针吸型活检术取121例假肥大型肌营养不良症患者(108例DMD患者,13例BMD患者)的肌组织,采用HE染色观察被检肌肉病理改变,免疫组织化学染色技术检测抗肌营养不良蛋白表达,以正常人肌细胞作为对照。结果 正常人肌细胞膜上抗肌营养不良蛋白染色阳性,呈完整环形条带沿肌细胞膜分布;DMD患者肌膜完全无显色;BMD患者染色弱阳性,可见沿肌细胞膜分布的间断表达。结论 应用针吸型活检技术和免疫组化染色法检测抗肌营养不良蛋白,有助于DMD和BMD确诊及鉴别诊断。

假肥大肌营养不良;免疫组化;抗肌萎缩蛋白

假肥大型肌营养不良是常见肌肉系统X连锁隐性遗传病,表现为进行性肌肉萎缩,发病者多为男性,分为 Duchenne型和 Becker型(DMD/ BMD)。本病主要是由于位于染色体Xp21.2肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因缺失所致该蛋白的缺失或表达异常[1],因此检测dystrophin有助于疾病诊断和分类。我们针对从2009年5月起治疗108例DMD和13例BMD患者,首次应用改良式针吸型活检术取患者肌肉进行形态学观察和抗dystrophin免疫组化研究,现将结果报告如下。

材料和方法

1.病例来源

收集解放军463医院细胞治疗中心住院的108例男性DMD患者和13例BMD患者资料,均经临床症状、肌电图、血清酶谱和核磁共振等确诊。对照组为正常人肌肉组织。

2.材料及试剂:抗dystrophin抗体购自Santa Cruz公司,SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术公司,TZ半自动活检枪购自北京德迈特贸易有限公司。

3.检测方法

3.1 冰冻切片制备:应用针吸型活检术吸取患者股四头肌,经OCT包埋剂包埋,液氮骤冷,置入恒冷式冰冻切片机切片,厚度均为8μm。

3.2 HE染色:切片经甲醇固定,苏木素染色5min,盐酸酒精分化后反蓝 15min,伊红染色3min,经梯度酒精、二甲苯后中性树胶封片。光镜下观察结果。

3.3 免疫组织化学染色

免疫组化检测 dystrophin蛋白的表达:切片经甲醇固定,3%H2O2溶液抑制内源性过氧化物酶,PBS洗涤3min×3次;用5%的正常羊血清于室温下封闭非特异性抗原20min;一抗用dystrophin抗体(1:100稀释),放入湿盒内4℃冰箱过夜;第二天用 PBS洗涤3min×3次,滴加二抗,室温孵育20min。用PBS代替一抗作为阴性对照,以正常人的肌组织切片作为阳性对照。显色,脱水,封片观察。

结果判定:dystrophin阳性反应位于细胞膜,呈棕黄色为阳性,不着色为阴性。

结 果

1.正常对照组:正常肌肉HE染色显示肌纤维大小均匀,呈网格状排列,核位于肌纤维的周边(图1)。免疫组化结果可见肌细胞膜上出现强度均匀一致棕黄色完整环状条带,为 dystrophin阳性表达(图4)。

2.DMD组:108例DMD患者肌纤维HE染色显示肌纤维大小不等,外形变圆,萎缩和肥大肌纤维并存,大量细胞核内移,其间纤维组织增生,脂肪组织浸润(图2)。免疫组化结果显示肌细胞膜均无着色,为dystrophin阴性(图5)。

3.BMD组:13例BMD患者肌纤维HE染色显示肌纤维同样存在大小不等,细胞核内移,但纤维组织增生和脂肪组织浸润的程度较DMD组轻(图3)。免疫组化结果显示肌细胞膜上棕黄色颗粒状间断出现,强度不一致,部分存在,呈斑片状分布(图6)。

图1 正常人肌肉组织HE染色(×400),肌纤维大小均匀,呈网格状排列;图2 DMD患者肌肉组织 HE染色(× 400),肌纤维明显萎缩,少部分肥大,其外形变圆,细胞核内移,其间大量的纤维增生;图3 BMD患者肌肉组织 HE染色(×400),肌纤维萎缩与肥大并存,细胞核内移,其间存在纤维增生;图4正常人肌肉组织冰冻切片dystrophin免疫组化染色(×400),dystrophin蛋白阳性,肌细胞膜上可见完整的环形条带;图5;DMD患者肌肉组织冰冻切片dystrophin免疫组化染色(×400),dystrophin蛋白阴性;图6 BMD患者肌肉组织冰冻切片dystrophin免疫组化染色(×400),dystrophin蛋白阳性,强度不均一,间断表达Fig.1 The HE staining of the muscular biopsy in the normal males(×400).The muscular fibers have similar size with grid-like arrangement;Fig.2 The HE staining of the muscle biopsy in the DMD patients(×400).There are a lot of muscular fibers showing obviously atrophy,some showing hypertrophy with central location of nucleus and proliferating fibrous tissue;Fig.3 The HE staining of the muscle biopsy in the BMD patients(×400).There is coexistence of atrophy and hypertrophy muscular fibers.Some muscular fibers have central location of nucleus;Fig.4 The immunohistochemical staining of the muscle biopsy in the normal males(×400).There is dystrophin protein expression in the muscular fibers and showing a complete circle strip in cell membrane.Fig.5 The immunohistochemical staining of the muscle biopsy in the DMD patients(×400), showing negative dystrophin protein expression in the muscles of the DMD patients.Fig.6 The immunohistochemical staining of the muscle biopsy in the BMD patients(×400),showing discontinuous dystrophin expression in the most musular fibers.

讨 论

假肥大型肌营养不良是一种常见肌肉系统 X连锁隐性遗传病,Duchenne型和Becker型为其中最常见两种分型。儿童以Duchenne型为多见。临床上患者多出现双下肢和四肢近端开始的肌无力、四肢近端肌萎缩、双腓肠肌假性肥大,血清肌酶升高、肌电图肌源性损害等特征性表现。Becker型肌营养不良为良性型肌营养不良症。发病年龄较小,症状较轻,预后较好。虽然两种病症状不太一样,但是发病机制都是由于 dystrophin基因的缺陷导致蛋白表达减少或消失造成。DMD或BMD疾病发生与肌细胞膜上dystrophin表达状况直接相关[2]。当肌细胞膜上 dystrophin完全缺失时,患者病情严重,为DMD;当dystrophin部分缺失时,患者病情较轻,为BMD[3]。肌肉活检是进行性肌营养不良确诊重要方法[4],因此,检测dystrophin非常有助于疾病诊断分型和研究。但是,由于患者大多为儿童,肌肉活检长时间来不便广泛开展。本研究中应用了针吸型活检技术进行免疫组化检测减轻了患者的痛苦,有利于Duchenne型和Becker型肌营养不良的确诊和鉴别诊断。虽然国内外都有应用免疫组化方法诊断该病,但是改良针吸式活检技术运用和大样本的检测,在国内外均为首次报道。

本研究结果显示在正常人肌肉中,dystrophin表达强度均一,位于细胞膜上,此为 dystrophin正常表达。此时可见肌细胞形态与结构均正常。在DMD患者的肌肉中,细胞膜上没有出现dystropohin表达,为 dystropohin缺失,因其是维持肌细胞形态重要因素,所以肌细胞形态出现萎缩和肥大,符合临床症状和其它各种检测结果。BMD患者肌肉检测中dystrophin在肌细胞膜上间断表达,强度不均一,这是由于 dystrophin的部分缺陷造成。阅读框架学说解释了DMD和BMD表型不同的原因。如果基因缺失破坏了开放阅读框,导致了dystrophin蛋白截断,造成dystrophin含量不足正常人3%,阴性表达,形成症状严重DMD表型;若基因缺失未破坏开放阅读框,经翻译产生的dystrophin长度缩短,可维持部分功能,因而表现为较轻临床症状BMD表型[5]。DMD和BMD患者肌细胞形态改变是因为基因突变造成细胞膜上dystrophin蛋白缺失破坏了细胞骨架,从而使得细胞膜不稳定,不能抵抗肌纤维的舒缩牵拉而损伤[6,7];另外,细胞膜通透性改变,使得细胞内钙浓度增加,激活了胞浆中钙蛋白酶[8],增加了对蛋白降解,加速了细胞膜破坏,导致肌纤维断裂、变性、坏死[9]。

综上所述,Dystrophin基因是目前已知人类最大的基因,由于其结构复杂,且有很高突变率,给检测带来很大困难,基因诊断等技术也有其局限性,而dystrophin缺失是DMD和BMD基本病理基础,不论 dystrophin基因有何种突变,绝大部分DMD患者存在dystrophin缺陷,检测dystrophin表达为DMD诊断提供了准确而简便的手段[10]。因此,运用针吸型活检术和免疫组化方法检测dystrophin蛋白表达不但使得DMD和BMD的诊断成为可能,更为临床表现有重叠,不易鉴别肌营养不良其他类型和某些代谢性肌病诊断和鉴别提供了重要的依据。

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IMMUNOHISTOCHEMICALSTUDY OF THE DYSTROPHIN EXPRESSION OF MUSCLE CELLS IN PATIENTS WITH PSEUDOHYPERTROPHIC MUSCULARDYSTROPHY

Song Nan,Yang Xiaofeng＊
(The463Hospital ofPeople′s Liberation A rmy,S henyang110042,China)

Objective To study the expression and diagnotic significance of dystrophin of muscle cells in patients with pseudohypertrophic muscular dystrophy.Methods The muscle specimens were obtained from 121 patients(108 DMD and 13 BMD)with pseudohypertrophic muscular dystrophy by using needle biopsy.The sections were treated with HE stain,and the pathological changes were observed.Dystrophin in muscle cells was detected by immunohistochemical technique and compared with normal muscle.Results The normal muscle showed ringed positive staining stripes around muscle cells.Negative result of staining was seen in 108 cases of DMD.The discontinuous positive staining was showed in 13 BMD.Conclusion Detecting dystrophin in muscles cells by needle biopsy and immunohistochemical technique is an efficient method for diagnosising and distinguishing DMD/BMD.

Pseudohypertrophic muscular dystrophy;Immunohistochemistry;Dystrophin

R446.8

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.014

2010-02-10

2010-04-01

宋楠,女(1980年),汉族,住院医师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)