田玉旺 李 琳 朱红艳 邢 宜 苗金红

(北京军区总医院病理科,北京100700)

提高冷冻切片制片质量的方法探讨

田玉旺 李 琳 朱红艳 邢 宜 苗金红

(北京军区总医院病理科,北京100700)

冷冻切片;质量;探讨

术中冷冻切片诊断是病理科的急诊工作,其重要性和责任性都很大。其中冷冻切片质量的好坏至关重要,它是许多病理技术人员一直探讨的问题。本文对影响制片质量的各种因素及环节进行了分析,并提出了可行的防范措施,使制片质量明显提高。

材料和方法

1.标本选取我院手术中的各种活体组织标本。

2.仪器德国徕佧-1900型冷冻切片机。

3.方法冷冻切片方法和染色方法基本同常规,切片厚5μm。

结果和讨论

在整个制片过程中注意文中所述细节后,制片质量明显提高,组织结构清晰,核浆染色鲜艳,组织内冰晶明显减少。

影响冷冻制片质量的因素较多,我们经大量实验及实际应用,认为在整个制片过程中应注意以下细节。

1.做好前期准备工作

1.1 日常工作中,仪器要定期进行擦拭、除霜、清洁消毒等,使冷冻切片机始终处于良好的运行状态。

1.2 切片刀要定期进行更换,调整好切片刀的角度,刀头刀架不要松动,不同的组织可使用不同刀片,一般组织选用R-35型,较硬的组织,如宫颈组织、子宫肌瘤等,使用A-35型较好。防卷板调整到最佳位置,防卷板要注意清洁,避免切片污染和切片出现皱褶。在切片过程中,尽量不要随意调整切片刀的角度和防卷板的位置,以免延长制片时间。

1.3 试剂及染液要定期进行更换,以保证染色质量。

2.取材方面

标本取材大小要合适,因为组织冷冻速度的快慢,依赖于温度、组织的大小及厚薄,取材大小一般为1.5×1.5×0.3cm为宜。取材时,尽量避开组织坏死出血区,要尽量剔除脂肪、毛发、骨及钙化物;取材时注意干燥,取材工具尽量不要接触水,囊性组织内有很多液体,取材时不要用水冲洗;若组织标本表面附着大量粘液或血液需用纸巾擦拭干净,不能用水冲洗。取材用的刀剪应当锋利,取材时避免刀来回挫动挤压组织。

另外,术中组织送检要及时,以保证标本新鲜。冷冻切片标本不要浸入酒精、生理盐水和甲醛液内;需要术中进行快速病理诊断的活检组织,最好用一次性塑料或乳胶手套盛放,切忌用干纱布、卫生纸或干棉花包裹组织,以免纱布等上面的线毛粘在组织上,不利于制片,且易损伤刀刃。

3.冷冻条件的设置

冷冻切片是借助在低温的条件下,使组织迅速冻结达到一定硬度进行切片的一种方法。一般工作时间内,箱体的温度设在-20℃左右,非工作时间设在-15℃左右较好。由于各种组织的结构不同,适宜的切片条件也有所不同。控制好冷冻组织的温度和冷冻时间是制作优质切片的关键。

3.1 肝脏、脾、脑、肾脏、甲状腺组织、淋巴结等细胞较丰富,纤维组织较少的标本,冷冻室温度一般控制在-16℃～-18℃左右,冷冻时间应当缩短,否则组织变脆、易碎,镜下形成裂隙,破坏了组织结构,影响诊断。冷冻时间控制在1min左右,且适当切薄。

3.2 对于质韧、硬的宫颈组织、子宫肌瘤等纤维多的组织,冷冻室温度一般为-19℃～-22℃之间,冷冻时间也不宜过长,控制在2min左右较好,过长会使组织变硬,不仅损刀而且组织片会出现裂痕、厚薄不均或呈帘状,染色时易脱片。切片时,速度可相对慢一些。

3.3 含脂肪的乳腺组织,冷冻室的温度一般控制在-25℃～-30℃左右;脂肪瘤等多脂肪的组织冷冻室的温度在-35℃以下,冷冻时间要适当延长,一般5min左右。脂肪含量多的组织标本,由于脂肪组织冰点低,只有低于-40℃才能冻硬,单压缩机的冷冻切片机达不到其冷冻温度,因此不易制片。双压缩机的冷冻切片机机头温度可在2-3min内降到-50℃,把冷冻托夹在机头的样本夹上,待脂肪组织冻硬后即可切出完整切片。另一种方法是:将脂肪组织放入液氮速冻后,利于切片。切片时进刀要快,否则切片粘连。

3.4 卵巢、肺、胆囊、胃壁、肠壁、胰腺等软组织,冷冻室的温度控制在-20℃～-22℃左右,冷冻时间2min。

3.5 睾丸、膀胱组织,冷冻室温度-18℃～-20℃,冷冻时间2min左右。

3.6 皮肤组织、肌肉组织,冷冻室温度一般控制在-22℃～-25℃,冷冻时间3min左右。

3.7 实验动物标本的冷冻温度和冷冻时间,在制片过程中均需相应的缩短。

4.包埋方面

囊壁、包膜等组织因较薄,冰冻切片时容易卷曲、折叠,可将这些组织切成长条状,然后把它卷曲成团,立着放在预冷好的冷冻托上,然后组织四周放适量包埋剂,使组织呈站立状态,以利于组织全层切片完整。

对破碎、较小的组织标本,如肾穿组织,采用先将少许包埋剂放在冷冻托上,待包埋剂冻凝后,用冷冻切片机修出包埋剂平面,然后取下冰托,将组织放在包埋剂平面上,再加少许包埋剂,冷冻后按原来的位置放在冷冻切片机上进行常规切片。本法在放组织前先将包埋剂的切面修好,形成细切状态,这样放上组织后就可直接对其进行修切,利于切片刀与组织的角度保持一致,易于切出组织最大面,防止把组织修切掉,避免了因组织过小而放弃制片或制片不理想的弊端。

5.切片方面

切片厚度一般为5μm,脂肪组织可稍厚些,淋巴组织3-4μm。切片时用力要均匀,先将组织轻修后再观察切面,看有无包膜、结节、钙化等,深修到组织最大切面。有包膜的一定要切完整,小的结节或重点病变部位要切到,避免漏诊、误诊。软硬不同的组织,质地较硬的部分应放在上面,如皮肤,将表皮面放在标本的上端,先切较软的皮下组织,依次切真皮、表皮。胃肠组织切片时应横向放置,粘膜面向下,浆膜面向上。

另外,要掌握好切片的最佳时机,一般情况下,将组织样品托放在速冻台上速冻,组织块从边缘开始冷冻变白,当变白区域逐渐向中央缩小,及时使用冰锤助冻,组织块立即全部变白瞬间,此时为最佳切片时机。

对于活检小组织冷冻时间相对短一些,以肉眼观察周围全发白时及时修整,避免组织过脆,切片时速度可相对慢且要匀速切片,过快会出现跳刀现象。

特殊组织如淋巴结,观察组织上部有一小点未完全冻凝时快速进行切片。

质地较硬的组织,如子宫肌瘤、宫颈组织等,以肉眼待冷冻组织中央反光区尚存光泽时为最佳切片时机。由于宫颈组织结构较致密,对冷冻的时间及温度较敏感,组织易冷冻过度,组织切片易出现搓板状或梯田状厚薄不均现象,因此必须注意观察,发现组织与冷冻托接触的面冻硬,且组织表面尚有少许光泽时即开始修块。如果冷冻过硬,可以用手贴在组织面上,使组织回温再切片。切片时将肌组织上下对角放置,可减少切片的阻力,易切成平整的薄片。

切片切好后用载玻片或盖玻片贴片时手不能颤抖,而且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动作,以防组织贴附不平或有皱褶。坏死组织等在染色过程中有时容易脱片,解决办法:首先切片不能太厚,切片后,先用酒精灯稍烤一下或用吹风机稍吹干,固定后行染色。

6.固定问题

组织固定是保证制片质量的关键,组织切片后立即固定能有效抑制或破坏组织细胞内各种酶的活性,沉淀蛋白质,防止组织自溶和腐败,保证组织细胞与正常生活时形态相似。经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰,便于辨认。冷冻切片若固定不佳,细胞易变形,细胞核变大,胞浆边界不清,细胞核着色力下降,染色结构模糊不清,影响诊断,所以切片后固定要及时、充分,不要在空气中停留时间过长,不提倡电吹风吹干后固定,否则细胞容易发生退变及细胞收缩。同时,固定液选择要得当,我们比较了甲醇、95%酒精、10%福尔马林、AAF液、丙酮、混合固定液(无水酒精45ml,甲醇45ml,冰醋酸10ml)六种固定液,我们认为混合固定液固定2min效果较好,组织结构清晰,细胞收缩小,核浆对比鲜明。固定后水洗要充分,以便将包埋剂洗干净,否则,切片背景不干净,影响观察。

7.染色方面

因新鲜组织对染液的亲和力较强,苏木素染30s-1min即可。为了缩短制片时间,可以使用加温的苏木素(40-50℃)进行染色。若细胞染色过浅或模糊不清,应适当延长固定时间和染色时间,当苏木素染色能力下降时应及时更换。分化要适当,分化过度核着色浅,分化不足细胞核的染色质看不清楚。

8.避免冰晶产生的主要措施

在常规冷冻制片过程中,我们发现冷冻组织切片中常含有大量的冰晶存在,特别是在脑、肌肉等组织冷冻切片中更为多见(图1)。冷冻组织切片内冰晶的消除问题,是大家试图解决的一个难点问题。由于冰晶的产生,使组织细胞形态发生了明显改变,致使临床病理诊断受到严重影响。

我们知道,水在-4℃时体积最大,这就意味着组织在-4℃左右的低温环境中停留时间越长,组织内所产生的冰晶的体积越大,数量越多,即组织内形成冰晶的数量与组织冷冻的速度成反比,因此,要尽量避免缓慢的冷却,使组织的温度迅速降到-4℃以下,可减少冰晶的形成。

我们经大量实验,认为日常工作中注意以下几点,可有效地避免组织内冰晶的产生(图2):

8.1 在不影响病理诊断的前提下,标本取材尽量小一些,组织厚度勿超过3mm,这样有利于组织的快速冻结,否则,组织过大,冷冻时间过长,组织内容易产生冰晶。

图1 传统方法,脑组织内冰晶较多。冷冻切片×100Fig.1 Traditional method.The ice crystal of brain tissue is much more.Frozen section×100

8.2 临床科若术中需要冰冻,应通知病理科,以便提前开机做好准备,这样可避免由于缓慢冷冻所产生的冰晶。因为冷却速度越快,过冷温度越低,所形成的晶核数量越多,晶体来不及生长就被冻结,从而失去了形成较大冰晶的机会。

8.3 标本托上的OCT等包埋剂不能放的过多,否则冷冻时间过长,也易产生冰晶。

8.4 送检的标本不要用生理盐水、酒精浸泡或用湿纱布包裹组织,由于液体浸泡后,组织内水分会增加,组织上的污物不能用水冲洗,否则,易造成冷冻后组织内冰晶形成增多。

图2 改良法,脑组织内冰晶明显减少,冷冻切片×200Fig.2 Modified method.The ice crystal of brain tissue is remarkablely reduced.Frozen section×200

8.5 低温骤冷组织:冷冻开始时,冰晶形成速率较慢,以后逐渐增加,其临界温度为-33℃,从-30℃降到-43℃之间,成核率急剧增加达10倍左右,然后再减慢。因此,缩短组织从-30℃降到-43℃的时间,可以大大减少冰晶的形成。在常规冷冻组织制片中,冷冻组织一般需要几分钟,从而常形成很多冰晶。根据上述理论,用-196℃液氮使组织快速冷冻,液氮能在几秒钟内将组织降到-196℃的超低温,最大限度地减少了冰晶的形成,对容易形成冰晶的肌肉、脑等组织采用液氮速冻,可减少冰晶的形成。含脂肪较多的组织采用此法亦较易制片。

8.6 有的单位使用普通胶水作为包埋剂,但需注意胶水不能太稀,尤其是制作小组织的切片时更要注意,以免胶水中过多的水分渗入组织中形成冰晶,造成细胞肿胀,影响诊断。

8.7 送检组织不要用水冲洗,以防人为因素带入水分;若组织本身水分较多,冷冻前可用滤纸或纸巾轻压吸干组织上的水分,以减少冰晶的形成。

8.8 巧用冷冻头的温度设置功能,一开始将冷冻切片机冷冻头温度设置的低一些,这样也可缩短组织的冷冻时间,减少冰晶形成机会。待组织冻好后,根据不同组织,再调到适宜温度。

另外,技术人员在整个制片过程中,要保持良好的心态,切勿急躁,接到标本后对组织的质地等要进行识别与判断,要根据组织的性质调整制片细节及注意事项。

R361.2

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.021

2009-12-20

2010-03-10

田玉旺,男(1962年),汉族,主任技师。