杜 锐，尹茉莉，时 坤，郑 鑫，兰海楠

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118）

抗鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

杜 锐1，尹茉莉1，时 坤1，郑 鑫2，兰海楠2

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118）

为建立鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV）检测方法，本研究制备了抗鹿源BVDV特异性单克隆抗体(MAb）。用纯化的BVDV免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经3次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选，获得2株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株2A3和4B12。通过间接ELISA检测，MAb效价为：上清液及腹水分别为 1∶512、1∶640和 1∶1 2800、1∶16 000；MAb的亚类鉴定结果表明，2株杂交瘤细胞分泌的抗体亚类均为IgGl亚类；经ELISA测定，2A3和4B12与BVDV C24V株、HCV、BDV、PRV均不发生交叉反应，但与BVDV CCSYD株发生交叉反应；IFA试验结果显示，4B12和2A3与接种BVDV N71株病毒液的细胞反应产生较强的特异荧光；抗原识别位点分析结果表明，2A3和4B12两株MAb所识别的抗原位点相同。这两株MAb的获得为鹿BVDV的检测方法的建立奠定良好的基础。

鹿；牛病毒性腹泻-粘膜病病毒；单克隆抗体；间接ELISA

牛病毒性腹泻粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黄病毒科瘟病毒属的成员之一，可感染偶蹄动物，与同属内的猪瘟病毒(HCV）及羊边界病毒(BDV）在血清学上存在着交叉反应[1-3]。鹿感染BVDV可造成母鹿流产，产死胎、弱胎、畸形胎，给养鹿业造成严重的经济损失[4]。目前，对鹿粘膜病的诊断方法有病毒分离、琼扩试验及中和试验等，这些方法存在检测时间长，检出率低等不足，不利于在临床诊断中广泛应用[5]。目前，利用单克隆抗体(MAb）研制了大量诊断试剂盒，应用于各种动物传染病的快速、准确的诊断。本研究进行了抗鹿源BVDV MAb杂交瘤细胞的制备和鉴定，为建立检测鹿BVDV的方法打下基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞及实验动物 BVDV N71株、BVDV CCSYD株(鹿源BVDV分离株），由吉林农业大学经济动物疫病实验室分离鉴定并保存；BVDV C24V标准株、HCV、猪伪狂犬病病毒(PRV）、BDV、MDBK细胞株均购自中国兽医药品监察所；SP2/0骨髓瘤细胞由吉林农业大学郑鑫教授惠赠；BALB/c小鼠为SPF级(6周龄～8周龄和10周龄以上）均购自卫生部长春生物制品研究所。

1.2 主要试剂 RPMI1640、牛血清白蛋白(BSA）、HRP标记的羊抗鼠IgG和羊血清均购自北京鼎国生物技术公司；HT选择培养基、HAT选择培养基、8-氮鸟嘌呤、弗氏完全和不完全佐剂、PEG2000和免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒均购自Sigma有限公司；新生牛血清购自杭州四季青生物材料公司；蛋白分子量Marker购自TaKaRa公司；E2蛋白由军事兽医研究所鲁会军惠赠。

1.3 动物免疫 BVDV N71株经蔗糖密度梯度离心技术纯化后作为抗原，按100 μg(0.1 mL）/只皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。初次免疫后的第14 d、第28 d，以弗氏不完全佐剂乳化抗原进行二免和三免。在三免后第10 d采血测抗体效价，当抗体效价达1∶104以上时，用不加佐剂的抗原100 μg/只尾静脉加强免疫，3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

1.4 间接ELISA检测方法的建立 参照常规方法建立间接ELISA检测体系。

1.5 细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选、克隆 细胞融合、克隆参照文献[6]的方法进行，并用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。

1.6 MAb的腹水制备 选取5只8周龄～10周龄健康雌性BALB/c小鼠0.5 mL/只腹腔注射灭菌液体石蜡；7 d～10 d后，接种1×106个/只～2×106个/只杂交瘤细胞；约7 d～12 d后收集腹水；间接ELISA法测定效价；采用辛酸-硫酸铵法提纯抗体。

1.7 细胞培养上清及腹水中MAb的效价测定 用间接ELISA方法测定杂交瘤细胞上清和腹水效价，以SP2/0细胞培养上清和阴性腹水作为阴性对照，以P/N≥2.1的最高稀释倍数为MAb的效价。

1.8 MAb特异性鉴定 应用间接ELISA检测腹水与 HCV、BCV、BVDV C24V、BVDV CCSYD的交叉反应性，同时以纯化的BVDV作为阳性对照，SP2/0细胞上清作为阴性对照，酶联检测仪测定OD490nm值，以P/N值≥2.1判为阳性。

1.9 间接免疫荧光试验 参照文献[7]的方法进行。

1.10 杂交瘤细胞的染色体分析 参照文献[8]的方法进行。

1.11 MAb的Ig亚类鉴定 采用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行MAb Ig亚类鉴定。

1.12 杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定 将杂交瘤细胞连续培养21代，取其初代细胞上清、每隔5代～10代细胞上清和冻存3个月后复苏并稳定培养的细胞上清用间接ELISA方法检测其分泌抗体能力的稳定性，同时设正常培养液为阴性对照。

1.13 MAb抗原识别位点的分析 参照文献[9]采用相加指数法，在确定各MAb饱和值的基础上进行相加试验，按公式AI=(A1+2-A1）/A2×100%计算相加指数，其中A1+2表示2株MAb叠加后的OD492nm值；A1表示第 1株 MAb的 OD492nm值；A2表示第 2株MAb的OD492nm值。AI<10%为2株MAb结合同一抗原位点，AI≥10%为2株MAb结合不同的抗原位点，AI值越大，抗原位点重叠的可能性越小。

1.14 Western blot鉴定 将BVDV N71株E2结构蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上，进行western blot鉴定。

2 结果与讨论

2.1 杂交瘤细胞株的建立 经3次细胞克隆纯化，最终获得2株能够稳定分泌抗鹿源BVDV N71株MAb的杂交瘤细胞株，分别定名为2A3、4B12。

2.2 MAb腹水的制备及效价测定 采用间接ELISA方法测定 2A3和 4B12腹水效价分别为1∶12 800和1∶16 000，明显高于细胞培养上清液的效价1∶512和1∶640。经测定纯化腹水 2A3和 4B12 MAb含量分别为 4.98 mg/mL，6.92 mg/mL。

2.3 MAb特异性分析 经间接ELISA法检测，筛选的2株MAb与BVDV CCSYD株反应呈阳性，而与HCV、BDV、PRV和BVDV C24V标准株反应均呈阴性，表明2株MAb只与鹿源BVDV特异性结合(表1）。免疫荧光试验鉴定，其结果也显示所获得的2株MAb与BVDV N71反应呈阳性(图1），特异性较好，为鹿源BVDV的诊断和疫苗研究提供了条件。

表1 单克隆抗特异性试验结果Table 1 Identification of specificity of MAbs to BVDV

2.4 杂交瘤细胞的染色体分析结果 两株杂交瘤细胞的染色体总数分别为97条和103条，具有杂交瘤细胞染色体特征。

2.5 MAb的Ig亚类鉴定 MAb亚类鉴定结果显示，MAb 2A3、4B12属于IgG1亚类抗体。

2.6 杂交瘤细胞株抗体分泌稳定性的测定 2A3和4B12株杂交瘤细胞连续培养21代后培养上清的效价保持不变，冻存数个月复苏后培养上清的效价分别为 1∶512 和 1∶640。

2.7 MAb抗原识别位点的分析 用相加ELISA法对MAb抗原识别位点进行分析，结果显示，当A1为2A3、A2为4B12时，叠加后AI值为8.04%；当A1为4B12、A2为2A3时，叠加后AI值为7.68%，均<10%，说明这2株MAb抗原识别位点相同。

2.8 Western blot鉴定 所获的两株MAb与BVDV N71株E2结构蛋白的western blot检测结果表明，2A3和4B12呈阳性反应(图2）。

本研究利用杂交瘤技术，获得了2株针抗鹿源BVDV MAb，培养细胞上清和腹水均具有较高的抗体效价。间接免疫荧光试验表明，其识别的抗原位点相同，这两株MAb的研制为开发诊断试剂、诊断方法奠定了基础。

[1]殷震，刘景华主编.动物病毒学[M].2版.北京：科学技术出版社，1997.

[2]Wensvoort G,Terpstra C.Bovine viral diarrhea virus infections in piglets born to sows vaccinated against swine fever with a contaminated vaccines[J].Res Vet Sci,1988(45）:143-148.

[3]王新平，宣华，朱维正，等.鹿感染牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的调查[J].中国畜禽传染病，1995(4）：41-42.

[4]韩坤，梁凤锡，王树志主编.中国养鹿学[M].北京：中国科学技术出版社，1993，405-406.

[5]郜玉刚，杜锐，王全凯，等.梅花鹿源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定[J].吉林农业大学学报，2005(1）：97-103.

[6]Zamorano P,Wigdorovitz A,Chaher M T,et al.Recognition of B and T cell epitopes by cattle immunized with a synthetic peptide containing the major immunogenic site of VP1 FMDV O1 Campos[J].Virology,1994,201(2）:383-387.

[7]何昭阳，胡桂学，王春凤主编.动物免疫学实验技术[M].长春：吉林科学技术出版社，2002，55-58.

[8]Butchaiah G,Morgan D O.Neutralization antigenic sites on type Asia-1 foot-and-mouth disease virus defined by monoclonal antibody-resistant variants[J].Virus Res,1997,52(2）:183-194.

[9]Thomas A M,Woortmeijer R J.Antigenic sites on Foot-and-Mouth disease virus type A[J].Virology,1988(62）:2782-2789.

Preparation and identification of specific monoclonal antibody against Sika bovine viral diarrhea virus

DU Rui1,YIN Mo-lin1,SHI Kun1,ZHENG Xin2,LAN Hai-nan2
(1.College of Chinese Medicinal Material,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.College of Animal Science,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China）

The monoclonal antibodies(MAbs）against bovine viral diarrhea virus(BVDV）was developed for the detection of BVDV infection in deer.Two hybridoma cell lines designated as 2A3 and 4B12 were produced by fusing mouse mycloma cells(SP2/0）with spleen cells from BALB/c immunized with BVDV N71 strain.The antibody titres of hybridoma supernatant and ascetic fluids of 2A3 and 4B12 were 1∶512,1∶640 and 1∶12 800,1∶16 000,respectively when detected by indirect ELISA.Indirect immunofluorescent assay(IFA）showed that both MAbs reacted specifically with BVDV N71 strain prepared in MDBK cells.The 2A3 and 4B12 could also react with BVDV CCSYD strain,but showed no cross reactions with BVDV C24V strain,classical swine fever virus,sheep border virus,and pseudorabies virus.The additive ELISA showed that 2A3 and 4B12 reacted with the same antigen determinant.

deer;bovine viral diarrhea virus;monoclonal antibody;inderict ELISA

S852.65

A

1008-0589(2010）08-0641-03

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.16

2009-05-23

国家自然科学基金项目(30671572）；吉林省杰出青年基金资助项目(20060104）；省部共建动物生产与产品质量安全教育部重点实验室资助项目

杜 锐(1971-），男，吉林前郭人，教授，博士，主要从事经济动物传染病研究.

(本文编辑：彭永刚）