马俊鹏，韩海霞，郭喜红，吴继周，包晓玮，张倩（.新疆维吾尔自治区人民医院药剂科，乌鲁木齐市 8000；.新疆农业大学药学院，乌鲁木齐市 8005；.新疆博尔塔拉自治州药品检验所，博乐市 8400）

正交试验优选啤酒花总黄酮提取工艺

马俊鹏1＊，韩海霞2，郭喜红1，吴继周3，包晓玮2，张倩2（1.新疆维吾尔自治区人民医院药剂科，乌鲁木齐市 830001；2.新疆农业大学药学院，乌鲁木齐市 830052；3.新疆博尔塔拉自治州药品检验所，博乐市 833400）

目的：优选啤酒花总黄酮的提取工艺。方法：以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数为考察因素，以总黄酮含量为指标，采用正交试验优选最佳提取工艺。结果：啤酒花总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度60%、提取时间80 min、料液比1∶25、提取次数3次。结论：该提取工艺简便、快捷，适用于啤酒花总黄酮的提取。

啤酒花；总黄酮；提取工艺；正交试验

啤酒花（Humunus lupulusL.）是大麻科草属多年生草质蔓生藤本，雌雄异株，花单性，雌性球穗花序简称酒花。主要分布于我国西北、东北、华东等地，含有树脂类、挥发油、总黄酮、多酚等多种化学成分。研究表明，啤酒花提取物及其复方制剂具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、镇静、雌性激素样等多种生物活性，在临床上常用于治疗结核、神经衰弱、麻风等多种疾病[1]。近年来研究发现，啤酒花中黄腐酚、异黄腐酚、五羟黄酮等总黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗血栓、植物雌激素样、降压等药理作用[2，3]。因此，开发啤酒花总黄酮在医药、食品和保健品等领域的新用途，将成为今后啤酒花总黄酮研究的重点。目前，国内、外对其提取工艺研究较少，笔者采用乙醇为提取溶剂，以总黄酮含量为评价指标，通过正交试验优选啤酒花总黄酮的最佳提取工艺，为啤酒花总黄酮的分离纯化、以啤酒花为原料开发药物奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52B型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6090型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-S型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；751型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；AL104-IC型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；JJ-140w型电动搅拌器（上海冠戈实业有限公司）；80-2型台式低速离心机（江苏金坛市医疗仪器厂）。

1.2 试药

啤酒花采自新疆昌吉农田，由新疆农业大学天然药物教研室鉴定为真品，室温阴干，置鼓风干燥箱中70℃烘干，粉碎，过60目网筛，保存于阴暗处，备用；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 啤酒花总黄酮的含量测定

2.1.1 提取方法：准确称取适量啤酒花粉末于烧瓶中，加入25倍量体积的60%乙醇溶液，60℃水浴回流提取3次，每次80 min，过滤，合并滤液，离心，上清液浓缩，将浓缩液置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇加至刻度，摇匀，得啤酒花总黄酮提取液。

2.1.2 芦丁对照品溶液的制备：称取芦丁对照品适量，干燥至恒重，精密称取10.00 mg，加60%热乙醇使其溶解并定容至100 mL，摇匀，制成0.1 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

2.1.3 啤酒花总黄酮供试品溶液的制备：精密吸取5.0 mL啤酒花总黄酮提取液，置于150 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，得啤酒花总黄酮供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察：分别精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁对照品溶液，参照文献[4]方法显色并制备空白溶液后在510 nm波长处测定吸光度。以芦丁浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝13.529C+ 0.005 9（r＝0.999 4）。结果表明，芦丁在0.005～0.05 mg·mL-1浓度范围内与其吸光度线性关系良好。

2.1.5 精密度试验：精密吸取芦丁对照品溶液4.5 mL，置于10 mL量瓶中，参照文献[4]方法显色并制备空白溶液后在510 nm波长处测定吸光度，平行操作5次。结果，RSD＝0.14%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验：称取同一批次啤酒花药材粉末6份，分别按“2.1.1”、“2.1.3”项下方法制备啤酒花总黄酮供试品溶液，参照文献[4]方法显色并制备空白溶液后在510 nm波长处分别测定吸光度，计算啤酒花总黄酮含量。结果，RSD＝1.75%，表明方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验：精密吸取9份啤酒花总黄酮供试品溶液各5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，分别加入芦丁对照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高浓度溶液各3份，再参照文献[4]方法分别显色后测定其吸光度，计算加样回收率。结果，平均加样回收率为99.8%，RSD＝1.64%（n＝9）。

2.1.8 总黄酮含量的测定：精密量取啤酒花总黄酮供试品溶液适量，参照文献[4]方法显色后测定其吸光度，代入回归方程，计算总黄酮含量。

2.2 啤酒花总黄酮最佳提取工艺的优选

2.2.1 正交试验设计：为寻求最佳提取条件组合，在单因素试验的基础上，选择乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）为考察因素，以总黄酮含量为指标，进行L9（34）正交试验。因素水平见表 1；正交试验结果见表 2；方差分析结果见表3。

由表2、表3可知，各因素影响程度依次为D＞C＞A＞B，即提取次数＞料液比＞乙醇浓度＞提取时间；乙醇浓度（A）、料液比（C）、提取次数（D）对提取率有显著影响。因此，选择最佳提取工艺条件为A2B1C2D3，即乙醇浓度为60%，提取时间为80 min，料液比为1∶25，提取3次。

2.2.2 验证试验：分别精密称取3批啤酒花各1.0 g，按上述最佳提取工艺条件提取，按“2.1.8”项下方法测定含量。结果，3批啤酒花总黄酮含量分别为37.82、37.99、38.04 mg·g-1，RSD＝0.3%（n＝3），表明提取工艺合理、稳定、可行。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

3 讨论

中药材通常采用浸泡、回流、超声辅助回流等方法进行提取。啤酒花药材中主要化学成分为黄酮类化合物，一般采用极性较大的溶剂（如甲醇、乙醇、水等）进行提取。笔者通过预试验比较了甲醇、乙醇、水作为提取溶剂的提取效率，结果发现乙醇提取效率高于甲醇和水；又比较了溶剂浸泡法、回流法和超声辅助回流法3种方法的提取效率，从节约成本、时间和可行性角度考虑，最终选择乙醇为提取溶剂，直接回流法作为啤酒花总黄酮的提取方法。

笔者曾进行了啤酒花药材粒度、乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比、提取次数的单因素筛选试验，结果表明啤酒花药材粒度、提取温度对提取效率影响不大，故选择对提取效率影响较大的乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数为考察因素，设计了正交试验，优选最佳提取工艺条件。

[1]周娟，邹翔，季宇彬.啤酒花的有效成分及活性研究[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2005，21（4）：414.

[2]骆怀民，李琳.多酚物质和酒花苦味物质的研究[J].啤酒科技，2002，9：66.

[3]朱丹，牛广财，姜述君，等.酒花的化学成分及药理作用[J].中国药业，2008，19（21）：1.

[4]王军民，韩丽琴，董顺福.黄芩中金属元素与总黄酮的含量测定[J].中国药房，2007，18（21）：1 641.

Optimization of the Extraction Technology of Total Flavonoids fromHumulus lupulusby Orthogonal Experiment

MA Jun-peng，GUO Xi-hong（Dept.of Pharmacy，People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China）
HAN Hai-xia，BAO Xiao-wei，ZHANG Qian（College of Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）
WU Ji-zhou（Bortala Mongol Autonomous Prefecture Institute for Drug Control，Bole 833400，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of the total flavonoids fromHumulus lupulus.METHODS：The extraction technology of total flavonoids was optimized by orthogonal experiment with the content of total flavonoids as index and with ethanol concentration，the ratio of material and solvent，extracting time and extracting frequency as factors.RESULTS：The optimal extraction technology was as follow：the concentration of ethanol was 60%；the extracting time was 80 min；the ratio of material to solvent was 1∶25 and extracting frequency was 3 times.CONCLUSION：The extraction technology is simple and rapid for the extraction of total flavonoids fromH.lupulus.

Humulus lupulus；Total flavonoids；Extraction technology；Orthogonal experiment

R 283；R284

A

1001-0408（2010）11-0994-03

2009-04-25

2009-10-12）