高文平，杨大坚，胡四琴，邹德学，曾薇，徐彷周，郭静，袁劲松#（.北京大学深圳医院，深圳市 5806；2.汕头大学医学院，汕头市 5504；.香港理工大学深圳研究院，深圳市 5806）

槟榔（Areca catechu L.）是棕榈科植物槟榔的干燥成熟种子，是一种常用中药，位居我国著名四大南药之首。槟榔嚼块是槟榔果实或果实与其它添加物混合的咀嚼物，目前全世界约有6亿人咀嚼槟榔嚼块。有研究表明，槟榔嚼块的流行与致癌、致突变、神经精神毒性、生殖毒性等有关[1]。生物碱是槟榔果实的主要活性成分，而研究槟榔碱对人精子质量影响的报道较少。本试验优选正常男性精子与不同浓度槟榔碱溶液共孵育，采用计算机辅助的精子分析系统（CASA）观察不同浓度槟榔碱溶液对人精子活率、活力、速度等指标的影响。

1 材料

1.1 仪器

CASA（北京清华同方软件股份有限公司）；DK-8A型电热恒温水槽（上海精密实验设备有限公司）；0412-1型MACRO精子计数板（上海蔡康光学仪器有限公司）。

1.2 试药

小牛血清白蛋白（BSA，美国Sigma公司）、Ham's F10培养液（美国Gibco公司）；氢溴酸槟榔碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111684-200401）。

2 方法与结果

2.1 标本收集

按WHO推荐的试验方法及标准[2]，从本院男科门诊送检的精液标本中，收集50例正常成年男性精液。年龄22～30岁。取样方法为：禁欲3～5 d，取样前48 h禁饮酒和咖啡等对精子有影响的食物或药物，手淫法收集标本于干净的容器并及时送验。

2.2 试液制备和精子优选

2.2.1 精子优选液的制备：取10 mL Ham's F10培养液，加入BSA 35 mg，调节pH值至7.4，用0.22 μm微孔薄膜过滤除菌，备用。

2.2.2 槟榔碱溶液的制备：取槟榔碱，用精子优选液分别配制成10、50、100 μg·mL-1，调节渗透压为290 mosm·kg-1的槟榔碱溶液。

2.2.3 精子优选：按文献方法[3]加以改良。取1支10 mL一次性医用注射器，抽入2 mL空气后再抽入精子优选液2 mL，最后缓慢抽入精液1.5 mL，避免震动，使精液与优选液分界清楚，将注射器针头护嘴套上，置注射器于37℃恒温水浴箱内的支架上固定（注射器按其内部的优选液和精液所呈现的交界面积最大的角度放置）。孵育45 min后缓慢直立，推弃优选液下方的精液，收集富含优选精子的优选液，500 r·min-1离心5 min，吸弃离心管中的上清液，用新鲜的优选液缓慢均匀吹散精子团块，并用新鲜的优选液调节终浓度至（40～80）×106·mL-1。

2.3 分组与孵育

试验分为4组，即对照（精子优选液）及槟榔碱高、中、低浓度（100、50、10 μg·mL-1）组。置于37 ℃恒温水浴箱培养，分别孵育0.5、1和2 h。

2.4 CASA进行分析

吸取充分混溶的孵化后的精子悬液10 μL，加到预温的MACRO精子计数板的样品槽中。将计数板置于显微镜载物台上，采用20×反相物镜选择8个视野检测，8个视野检测的精子总数不少于300个精子，用显微摄像机和录像机记录精子的运动图像，进行软件处理，即得各运动参数：精子活率（Mot，%）、a+b级运动精子百分率[（a+b）PM，%]、曲线速度（VCL，μm·s-1）、直线速度（VSL，μm·s-1）。

2.5 统计学方法

2.6 槟榔碱对人体外精子运动能力参数影响试验结果

经CASA分析，不同时间段槟榔碱溶液对体外Mot有显著影响，使Mot降低。与对照组比较，槟榔碱低浓度组1、2 h后Mot显著下降（P＜0.01）；槟榔碱高、中浓度组0.5、1、2 h后Mot显著下降（P＜0.01）。不同时间段槟榔碱溶液使（a+b）PM下降。与对照组比较，槟榔碱高、中浓度组0.5、1、2 h后（a+b）PM显著下降（P＜0.01或P＜0.05）。与对照组比较，不同时间段高、中浓度组VCL显著下降（P＜0.01）；槟榔碱低浓度组2 h后VCL显著下降（P＜0.01）。不同时间段槟榔碱溶液使VSL下降。与对照组比较，槟榔碱高、中浓度组0.5、1、2 h后VSL均显著下降（P＜0.01或P＜0.05）。可见，槟榔碱溶液在不同作用时间和不同作用浓度的情况下，精子各运动参数均有显著性差异。槟榔碱浓度越高，作用时间越长，精子运动能力越低，从而说明槟榔碱能降低正常男性体外精子运动能力且与浓度时间成正比。不同时间段槟榔碱溶液对Mot、（a+b）PM、VCL、VSL的影响分别见表1、表2、表3、表4。

表1 不同时间段槟榔碱溶液对Mot的影响（，n＝50）Tab 1 Influence of Ar solution on the Mot of sperm in different period（，n＝50）

表1 不同时间段槟榔碱溶液对Mot的影响（，n＝50）Tab 1 Influence of Ar solution on the Mot of sperm in different period（，n＝50）

与对照组比较：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

2时间/h 1组别对照组槟榔碱低浓度组槟榔碱中浓度组槟榔碱高浓度组59.13±6.5556.65±5.18＊54.85±9.79＊29.59±8.79＊浓度/μg·mL－1 010501000.569.80±5.2972.31±7.4061.72±7.97＊42.95±7.73＊66.87±6.1662.24±9.37＊58.43±7.78＊37.89±6.84＊

表2 不同时间段槟榔碱溶液对（a+b）PM的影响（，n＝50）Tab 2 Influence of Ar solution on the（a+b）PM of sperm in different period（，n＝50）

表2 不同时间段槟榔碱溶液对（a+b）PM的影响（，n＝50）Tab 2 Influence of Ar solution on the（a+b）PM of sperm in different period（，n＝50）

与对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2时间/h组别对照组槟榔碱低浓度组槟榔碱中浓度组槟榔碱高浓度组浓度/μg·mL－1 010501000.554.61±6.3153.74±4.1551.03±7.80＊35.44±9.57＊＊150.43±6.8347.66±8.1344.10±6.87＊＊29.69±8.15＊＊42.87±6.4041.38±7.3238.12±8.72＊＊22.82±7.59＊＊

表3 不同时间段槟榔碱溶液对VCL的影响（，n＝50）Tab 3 Influence of Ar solution on the VCL of sperm in different period（，n＝50）

表3 不同时间段槟榔碱溶液对VCL的影响（，n＝50）Tab 3 Influence of Ar solution on the VCL of sperm in different period（，n＝50）

与对照组比较：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

组别对照组槟榔碱低浓度组槟榔碱中浓度组槟榔碱高浓度组时间/h剂量/μg·mL－1 010501002124.70±3.3320.46±4.24＊13.71±6.03＊12.55±5.34＊0.530.79±3.9229.91±3.6928.49±4.53＊26.21±2.32＊27.32±3.8326.79±4.4422.94±3.31＊20.33±3.9＊

3 讨论

本研究发现不同浓度的槟榔碱溶液，作用一定时间后，对正常人精子体外运动各参数均有影响。

表4 不同时间段槟榔碱溶液对VSL的影响（，n＝50）Tab 4 Influence of Ar solution on the VSL of sperm in different period（，n＝50）

表4 不同时间段槟榔碱溶液对VSL的影响（，n＝50）Tab 4 Influence of Ar solution on the VSL of sperm in different period（，n＝50）

与对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别对照组槟榔碱低浓度组槟榔碱中浓度组槟榔碱高浓度组时间/h剂量/μg·mL－1 010501000.517.20±2.9716.66±3.6915.49±3.86＊＊10.24±2.37＊＊1213.00±3.9612.56±4.819.21±2.98＊＊7.97±2.85＊＊15.04±3.1213.74±4.0513.46±4.49＊10.24±2.37＊＊

近年来，男性不育成逐年递增的趋势，导致男性不育的原因主要有精子数目减少、精子活力或受精能力低下，而足够的精子数量和适当的运动能力是男性生殖能力的重要保障，在毒理学上已将精子计数、精子形态以及精子活动力作为男性生殖健康的重要判断指标[4]。药源性生殖功能损害虽然不会威胁生命，但会影响性生活质量和怀孕能力，也影响药物治疗的依从性[5]。目前，关于槟榔碱对精子运动能力各参数的影响主要集中在动物实验，而槟榔碱直接对人精子运动参数的影响报道较少。

文献报道槟榔嚼块和槟榔碱存在致癌的副作用[6]，印度学者Mukhefiee-A等曾报道槟榔对雄性小鼠生殖细胞有负面影响。胡怡秀等[7，8]采用小鼠交配实验观察槟榔提取液对雄性小鼠生育力的影响，发现雌鼠的受孕率呈现出随剂量增加而下降的剂量反应关系，各实验组仔鼠出生时体质量显著低于对照组，表明槟榔对雄性小鼠生育能力及仔鼠生长发育可能存在一定影响；采用精子计数、精子活动率、精子形态学指标观察了槟榔水提取液对雄性小鼠精子的影响，结果发现槟榔能使小鼠精子数量显著减少、精子活动率显著降低、精子畸形率显著升高；采用小鼠交配实验，观察了槟榔对小鼠扑捉潜伏期、交配潜伏期、平均扑捉次数、平均交配次数、扑捉动物数和交配动物数的影响，结果表明槟榔可导致小鼠性功能显著减低。

精子本身的结构特点和物质基础决定了精子具有活跃运动的生物学特征，这也是正常生理状态下完成受精过程的基础。各种因素造成的精子功能障碍和结构异常可以通过精子的运动表现出来，而CASA系统可以客观、精确、准确地发现多种因素对精子运动的影响。常用的精子运动参数包括：Mot，是表示前向运动精子与精子总数的比值；a级向前运动精子百分率，即快速前向运动（即37℃时速度≥25 μm·s-1，或20℃速度≥20 μm·s-1）精子占精子总数的比值；b级前向运动精子百分率，即慢速或呆滞的前向运动精子占精子总数的比值；VSL，是指精子从运动的起始点到终点的位移与所需时间的比值；VCL，是指精子从运动的起始点到终点的运动轨迹路程与时间的比值。已有研究表明，精子的VCL、VSL等运动参数与受精率呈显著相关关系。因此，精子的运动特点是综合反映精子质量最直观、敏感的指标。

本研究应用CASA系统，观察了不同浓度槟榔碱溶液对正常男性精子体外运动能力的影响，结果显示随着槟榔碱浓度的增高和时间的延长，正常男性体外精子运动能力显著降低。本课题组已有研究表明，50、100 μg·mL-1等较高浓度槟榔碱溶液在作用一定时间后，Mot、（a+b）PM、VCL、VSL等精子运动各参数均有显著降低。本研究进一步证明槟榔碱具有生殖毒性作用，为槟榔碱具有雄性生殖毒性提供了直接证据。此结果还提示，随着槟榔碱浓度和作用时间的增加，其对精子的毒性作用越来越强。

本研究方法具有耗时短、影响因素易于控制等特点，但是本试验未能阐述槟榔碱对正常男性精子体外运动能力影响的作用机制，也未能阐述食用槟榔是否对男性生殖功能有直接影响，这些还有待于进一步研究。

[1]赵云霞，于 蕾，季宇彬，等.槟榔的毒理研究进展[J].药品评价，2006，6：457.

[2]谷翊群，陈振文，于和鸣，等.WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用试验手册[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2001：3.

[3]王学本，李科茂.简易上游法优选精子治疗少、弱精子症的临床应用[J].中国男科学杂志，1998，12（4）：224.

[4]Harada S，Sakaguchi Y，Shimada M，et al.Male reproductive toxicity study of nefiracetam in rats[J].Toxicol Sei，1995，20（3）：309.

[5]冯艳梅，杨剑弘.药源性生殖功能损害[J].中国药房，2008，19（14）：1104.

[6]Hazarey VK，Erlewad DM，Mundhe KA，et al.Submucous fibrosis：study of 1000 cases from central India[J].Oral Pathol Med，2007，36（1）：12.

[7]胡怡秀，臧雪冰，丘 丰，等.槟榔对雄性小鼠性功能的影响[J].中国公共卫生学报，1999，18（1）：27.

[8]胡怡秀，臧雪冰，丘 丰，等.槟榔对小鼠精子的影响研究[J].癌变畸变突变，1999，11（1）：39.