周 权,王宝玉

(1.安徽农业大学研究生学院,安徽合肥 230036;2.阜阳师范学院附属中学,安徽阜阳 236041)

家蚕基因组P450基因家族的分析

周 权1,王宝玉2

(1.安徽农业大学研究生学院,安徽合肥 230036;2.阜阳师范学院附属中学,安徽阜阳 236041)

利用家蚕基因组mRNA和氨基酸数据库对P450基因进行搜索,结果显示:在家蚕基因组中发现77个P450基因,分别归于18个P450家族和26个亚家族,其中有9个多基因家族,3个基因家族的成员超过10个,CYP4有20个成员,是一个典型的多基因家族。对P450基因进行正选择、基因转换和基序分析,结果表明:1个组(包含3个P450s基因)中检测出了显著的正选择替换位点,在这1个组中,转换事件的次数为3次。

家蚕;细胞色素P450;正选择;基因转换

细胞色素P450加单氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,P450s)是一类由超基因家族编码的含血红素和巯基的结合蛋白[1]。P450的重要特征是还原型细胞色素P450与CO结合形成的复合物,在波长450nm处有最大的特征性吸收峰(γ峰),细胞色素P450命名正是由来于此。P450的系统命名是根据氨基酸序列的相似程度作为划分P450家族与亚家族的依据,并用数字和字母分别代表P450家族与亚家族的名字,同源性超过40%的为同一家族的基因成员,而同源性超过55%以上,则为同一亚族成员。P450广泛分布于各种生物中,参与许多外源物质(如杀虫剂、环境有毒物质)和内源物质(如激素、脂肪酸)的代谢,是重要的代谢酶系[2],如昆虫的CYP6和CYP9及甲壳动物的CYP2都具有抗植物毒素的功能,果蝇的CYP18和东亚飞蝗CYP6H1分别参与蜕皮类固醇激素的代谢和活化。

家蚕(Bombyx mori)属鳞翅目蚕蛾科,普遍存在,广大桑农普遍饲养,是生态学、进化生物学和环境科学研究较为理想的模式生物。家蚕基因组数据库于2003年由中国科学家率先公布,为研究家蚕中P450基因家族提供了条件。本文通过对家蚕全基因组P450基因种类的鉴定、正选择方式和基因间序列重组和交换的评估来研究P450基因家族的进化规律。

1 材料与方法

1.1 全基因组P450基因的鉴定

以家蚕为研究对象,基因组序列与基因序列来自于silkworm genome数据库(http://silkworm.genomics.org.cn/,下载时间2009年3月)。家蚕全基因组中P450首先用P450的HMM(Hidden Markov model)序列在本地家蚕 mRNA数据库中进行TblastN(E value threshold>0.01)搜索,得到所有可能是P450类型基因的序列;再到相应的氨基酸数据库寻找相对应的氨基酸序列,然后将这些基因序列对应的氨基酸序列分别通过 Pfam程序检验其是否含有 P450结构域。对所获得的 P450基因在 http://www.cyped.uni-stuttgart.de/中,E-value小于等于1e-7的情况下作BLASTP比对,进行基因家族和亚家族的命名。

1.2 P450基因的分组

利用MEGA4.0对所有序列进行距离法(Neighbor -Joining method)系统树的构建,对系统树进化枝中的基因根据氨基酸相似度大于60%的标准分组。

1.3 P450基因正选择和基因转换分析

本文ω的计算使用PAML软件包中的codeml程序,分别在不同的密码子替代模型M7和M8下进行计算,这两种模型的适合度通过likelihood ratio(LR)统计方法来检验。正选择的氨基酸位点通过PAML中的Bayesian方法计算得到。组内基因间的序列交换检验采用 GENECONV1.81程序默认参数来完成。P< 0.05为具有统计意义的基因交换事件。

2 结果分析

2.1 家蚕P450的基因的种类和分组

对家蚕mRNA分析结果表明:家蚕基因组含有P450基因77条。根据它们的氨基酸序列相似程度划分而归属于18基因家族和26亚家族,其中有9个多基因家族,3个基因家族的成员超过10个,CYP4有20个成员,占家蚕P450基因的26.0%。

图1 家蚕P450基因的系统树

并利用MEGA4.0对家蚕基因组77条P450基因编码区的核苷酸序列排序,按距离法构建了系统树(图1),反映了77条P450基因之间的进化关系。为更好地分析基因正选择和基因转换,我们对其进行了分组,分组标准为系统树进化枝中基因的氨基酸相似度大于60%。结果显示:家蚕77条 P450基因中的44条序列可归入12个组,而其余的9条基因序列因差异太大而不能被归入任何一组。在这12组中,由于正选择位点的 PAML分析以及基因转换的 GENECONV要求最少有3条序列,因此,最终用于正选择和基因转换分析的序列共3组,包含11条序列。

2.2 家蚕P450正选择、基因转换及其相互关系

对P450基因3个组中的11条基因进行正选择位点的分析,同时满足下列两个条件即判断为显著的正选择:(1)对于M7-M8的LR检验,其结果2Δl的显著程度根据其相对于χ2(d.f.=1)的分布值进行判断,即当2Δl>3.84时,P<0.05,显示为显著;2Δl>10.83时,P<0.001,显示为极显著;(2)M8计算结果中ω> 1.0。结果显示(表1):1个组,包含3条基因,符合上述条件,说明这些基因可能受到正选择压力作用。其中1个组,包含3条基因,利用M8中Bayesian方法检验出14个概率大于95%的正选择氨基酸位点。

在11条 P450基因构成的3个组中,有1个组(包含4个基因)检测出了统计上具有显著意义的基因转换事件(表2)。在 P450基因3个组中,检测出显著正选择位点的基因共3个;检测出参与基因转换的基因2个;既没有检测出正选择位点,又没有检测出基因转换的基因6个(表2)。

表1 LR检验结果

表2 P450基因的正选择和基因转换的分析

表2中黑体序号代表处于正选择压力的组;黑体基因序列名称代表参与基因转换的基因。

3 讨论

与果蝇(86个P450基因)和按蚊(105个P450基因)等昆虫的P450家族相比[3],家蚕该基因家族的数量少于上述昆虫。在果蝇和按蚊等昆虫中P450含有较多的CYP4和CYP6家族,而家蚕P450含有较多的CYP4、CYP6和CYP9家族。其中CYP4家族基因可能与气味分子代谢有关,使嗅觉组织免受伤害,同时也有报道它们可能与气味识别有关。CYP6A与外源性毒物代谢有关,CYP6B主要是被植物毒素所诱导[4,5],同时也被植物信号分子所激活。这也许是由于不同昆虫的生活环境和习性不同所致,从而使它们的代谢途径和抗外源化合物机制不同。

研究表明,在表面受体蛋白、寄主防御系统(如人类的MHC)、植物NBS-LRR和哺乳动物的P450基因中,正选择作用都普遍存在[6]。我们使用 PAML程序对P450基因家族11条序列进行正选择分析,其中3条P450基因序列中含有显著性的正选择位点。Healther等(2006)研究发现CYP1A亚家族基因旁系同源(paralog)存在正选择现象,正选择区域主要位于底物结合位点SSR3、SSR4和酶催化有关的位点Helix I。da Fonseca(2007)研究显示哺乳动物 P450基因的正选择位点也主要存在于底物结合位点(SSR)。可见,底物结合位点和酶催化相关位点的正选择有利于P450根据环境中多样的内源和外源化合物来拓宽和改变底物的专化性。家蚕P450基因的正选择位点是否也存在于底物结合区有待于研究。

因为GENECONV程序不能严格区分不等价交换与经典的基因转换,我们所研究的基因转换其实包含了经典的基因转换和基因间的不等价交换两层含义,这在多基因家族的进化中起着重要的作用。家蚕P450基因家族3个基因组中,有1个组(包含2个基因)检测出了具有统计上显著意义的基因转换事件。基因转换事件发生频繁的基因更容易受正选择作用的原因可能是,频繁发生基因转换的基因更容易受到正选择而得以保存,当然,受正选择压力的基因不仅只有基因转换这一种突变方式,点突变等其它突变方式也可能被选择保存。

[1]DoddapaneniH,ChakrabortyR,YadavJS.Genome-wide Structural and Evolutionary Analysis of the P450 Monooxy Genase Genes(P450ome)in the White Rot Fungus Phanerochaete Chrysosporium:Evidence for Gene Duplications and Extensive Gene Clustering[J].BMC Genomics, 2005,6:92-116.

[2]Li L,Cheng H,Gai J et al.Genome-wide IdentiWcation and Characterization of Putative Cytochrome P450 Genes in the Model Legume Medicago Truncatula[J].Planta, 2007,226:109-123.

[3]Poupardin R,Reynaud S,Strode C et al.Genomic Analysis of Detoxification Genes in the Mosquito Aedes Aegypti [J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2008,38 (1):113-123.

[4]Wen,Z.M.,Berenbaum,M.R.,and Schuler,M.A.Inhibition of CYP6B1-mediated Detoxification of Xanthotoxin by Plant Allelochemical in the Black Swallow (Papilio polyxenes)[J].Journal of Chemical Ecology,2006,32(3): 507-522.

[5]Grubor,V.D.,and Heckel,D.G.Evaluation of the Role of CYP6B Cytochrome P450s in Pyrethroid Resistant Australian Helicoverpa Armigera[J].Insect Molecular Biology,2007,16(1):15-23.

[6]季军,杨四海,田大成.水稻基因组中抗病基因正选择方式及基因转换的研究[J].中国农业科学,2007,40(9):1856 -1863.

A Genome-wide Analysis of P450 Gene Family in Silkworm

ZHOU Quan1,WAN G Bao-yu2
(1.Graduate School,A nhui A gricultural University,Hef ei230036,China;
2.The A f f iliated Middle School,Fuyang Teachers College,Fuyang230062,China)

A genome-wide analysis of P450 genes were performed in silkworm genome based on their mRNA and amino acid data.77 P450 genes,assigned into 18 gene families and 26 subfamilies,were identified,it contains 9 multi-gene family,3 gene family has more than 10 members in it.CYP4 have 20 members,is a typical multi-gene family.P450 genes of silkworm positive selection,gene conversion and base sequence analysis,results showed that:A group(including three P450s genes)detected significant site is to choose the replacement,in this one group,the number of conversion events 3 times.

silkworm;cytochrome P450;positive selection;gene conversion

Q969.9

A

1009-9735(2010)05-0074-03

2010-08-06

周权(1976-),男,安徽肥东人,助理研究员,在读博士生,研究方向:分子生物学。