李贤宇，张蕊，周博

（天津渤海职业技术学院，天津 300402）

酪酸菌培养条件的优化

李贤宇，张蕊，周博

（天津渤海职业技术学院，天津 300402）

酪酸菌为人和动物肠道内正常菌群中的一种有益菌，能产生各种维生素，对人体具有保健作用，酪酸菌的芽孢是一种较理想有开发前景的微生态制剂。制备酪酸菌微生态制剂首先要实现酪酸菌的高密度培养，其次是获得较高酪酸菌芽孢转化率，本文对酪酸菌的培养条件进行了优化，取得良好的效果。

酪酸菌；培养条件；优化

酪酸梭状芽孢杆菌（酪酸菌），又称丁酸菌，是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的[1]。该菌在于土壤、酸奶、动物和人体的肠道等厌氧环境中，菌体为直或微弯曲，大小为0．6～1．2×3．0～7．0 μ，端圆，周生鞭毛，能运动。菌体中常有圆形或椭圆形芽孢，菌体中部膨大呈梭形，芽孢偏心或次端生、无芽孢外壁或附属丝。

酪酸菌为人和动物肠道内正常菌群中的一种有益菌[2，3]，能够大量补充肠道内正常菌群的数量，促进其它有益菌群的增殖；能产生B族维生素、维生素K、丁酸等物质，对人体具有保健作用。并能在肠粘膜表面形成微生物屏障，阻止有害菌的定植和入侵，有效地改善肠道内微生态环境，是一种较理想的有开发前景的微生态制剂。制备酪酸菌微生态制剂首先要实现酪酸菌的高密度培养，其次是获得较高酪酸菌芽孢转化率，因此，使酪酸菌的培养浓度和芽孢转化率均获得较大幅度的提高。已成为研究和开发酪酸菌微生态制剂的关键。本文就此实验对酪酸菌的培养条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

菌种：酪酸菌，天津渤海职业技术学院微生物实验室分离保藏菌种。

主要仪器：高速离心机（北京医用离心机厂），磁力搅拌器，氮气钢瓶。

1.2 实验方法

1.2.1 摇瓶发酵培养基

胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏3 g，葡萄糖5 g，氯化钠5 g，可溶性淀粉1 g，L-半光氨酸盐0．5 g，乙酸钠3 g，溶于1000 mL水中，调pH7．5。

1.2.2 菌体浓度的测定

采用活菌计数法，取1 mL发酵液加入到9 mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍梯度稀释，选取三个适当的稀释倍数，吸取1 mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15 mL培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿。待培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48 h。选取菌落在30～300之间的培养皿计菌落数。

1.2.3 芽孢浓度的测定

取菌液5 mL，于80℃水浴加热10 min，杀死营养体细胞，然后采用上述活菌计数法计数。

2 结果与讨论

2.1 酪酸菌接种量对菌体浓度的影响

接种量大小对培养结果有一定影响，接种量过大会带入较多的种子培养期的代谢产物，并使菌体前期生长过快，从而会造成培养后期的代谢副产物大量累积，使最终菌浓有所降低；接种量过小则使菌体增殖缓慢，培养时间延长。

实验分别采用了2%、5%、10%和15%四个接种量进行培养，培养20 h后结果见图1。由图1可知，在培养20 h之后，15%接种量组已进入稳定期，但菌体浓度并不是最高；2%和5%接种量组仍处于指数期，生长过慢；而10%的接种量可使菌浓达到较高水平。

图1 接种量对菌浓的影响

2.2 培养温度对菌体浓度及芽孢转化率的影响

选不同的培养温度进行实验比较，菌体的生长情况和芽孢转化率如图2所示。从图2可知，酪酸菌生长的最适温度为37℃，较高或者较低的温度对酪酸梭状芽孢杆菌的生长影响较大；但当温度低于或者高于37℃时，菌体的芽孢转化率却有所增加。

图2 培养温度对酪酸菌生长及芽孢转化率的影响

为了在不降低菌体浓度的情况下提高芽孢转化率，实验采用了两步培养法。首先在37℃培养，待菌体到达稳定期后，适当的降低或者提高培养温度，芽孢的转化率如表1所示。从表1可以看出，当酪酸菌培养至稳定期（20 h）后，温度降至30℃继续培养至32 h时，所得到的芽孢生成率可达95%；升高温度也有利于芽孢的形成，但当温度高于40℃时，菌体死亡很快，最终虽然获得的芽孢生成率较高，但由于菌体数目的大幅度减少，芽孢的总体收率降低。

表1 20 h后改变培养温度对芽孢转化率的影响

2.3 氮气保护实验

对于专性厌氧菌——酪酸梭状杆菌来说，对其生长造成强烈影响的是进入三角瓶中的空气以及该部分气体和发酵液的混合程度。由于实验过程中间断性地进行取样，带入空气不可避免，为了消除这两个方面的影响，实验采用了氮气保护和发酵栓同时使用的方法，实验装置如图3所示。

图3 氮气保护实验装置

以10%接种量接种后，安装好发酵栓，打开进气阀门通入氮气，将滞留在三角瓶内的空气赶出，然后关闭进气阀（每次中间取样结束后重复此步操作）。将培养装置放入厌氧箱，并开启磁力搅拌器轻微搅拌，分别测定两种情况下的菌体浓度：（1）每隔2 h取样一次，培养20 h后测定菌体浓度；（2）培养过程中不取样，培养20 h后测定菌体浓度。并与静置培养比较，如图4所示。

图4 两种培养方式下菌体浓度比较

从图4中可以看出，静置培养时，酪酸菌的菌浓要比采用发酵拴进行氮气保护培养时低得多，其主要原因是由于后者使用了磁力搅拌，使培养液与菌体均匀混合，促进了菌体与培养液之间的物质交换。如果每2 h取样一次，静置培养由于受进入三角瓶内空气的影响，菌浓下降幅度较大；而对于氮气保护实验而言，整个培养过程中取不取样对菌浓的影响不大。由此可见，氮气保护实验很好的消除了由于间断取样造成的氧对酪酸菌生长的危害。

2.4 培养时间的确定

将菌种接种于上述培养基中，依照上述培养条件，采用发酵栓进行氮气保护培养实验，每隔2 h对培养期间的菌浓、pH值和芽孢转化率进行取样测定，结果如图5所示。从图5可看出菌体的最高浓度出现在20 h；芽孢的最大转化率出现在36 h，但此时由于菌体的浓度下降幅度较大，并不是芽孢的最佳收获时期，综合考虑，芽孢的最佳收获时期应在30～32 h之间。

图5 酪酸菌的生长曲线图

3 结论

3.1 单因子实验表明，酪酸菌的最佳接种量为10%。

3.2 酪酸菌生长的最适温度为37℃；但待菌体到达稳定期后，适当的降低培养温度却有利于芽孢的形成。当酪酸菌培养至稳定期（20h）后，温度降至30℃继续培养至32h时，所得到的芽孢生成率可达95%。

3.3 对于专性厌氧菌——酪酸梭状杆菌来说，对其生长造成强烈影响的是进入三角瓶中的空气以及该部分气体和发酵液的混合程度。由于实验过程中间断性地进行取样，带入空气不可避免。实验采用氮气保护和发酵栓同时使用的方法，很好地消除了由于间断取样造成的氧对酪酸菌生长的影响。

3.4 酪酸菌的生长曲线表明，细胞的最佳收获时间为20 h、芽孢的最佳收获时间为30～32 h之间。

［1］ 庄志发，冯紫慧.简述微生态活菌（酪酸菌）制剂的研究应用[J].山东食品发酵，1999，（1）：32～35.

［2］ John Marinko,Michael Madigan.Brock Biology of microorganisms [M].Prentice Hall,2005.

［3］ 宋会仪，吴天星.酪酸菌微生态制剂的生物学功能及在饲料中的应用[J].饲料工业，2006，27（12）：10～11.

Optimization of clostridiun butyricum culture condition

LI Xian-yu,ZHANG Rui,ZHOU Bo
(Tianjin Bohai Vocatinal Technical College,Tianjin 300402)

As a beneficial bacteria,clostridium butyricum can produce a variety of vitamins,and has a health care on the human body．The spores of Clostridium butyricum are ideal microecological agents which have development prospects．Clostridium butyricum high-density culture must be carried out first before the preparation of microecological agents,followed by a higher conversion rate of butyric acid bacteria spores．Clostridium butyricum culture conditions were optimized in this paper and achieved good results．

clostridium butyricum;culture conditions;optimization

book=3,ebook=22

10．3969/j．issn．1008-1267．2010．01．008

Q839.1

A

1008-1267（2010）01-0022-03

2009-10-12