张 代，李慧芬，马 成

（1.商丘职业技术学院，河南商丘476000；2.青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛，266061）

根源生物技术专栏

一种富含酪酸菌发酵豆粕的制备

张 代1，李慧芬2，马 成2

（1.商丘职业技术学院，河南商丘476000；2.青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛，266061）

DO I：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162308

本研究制备了一种复合固态发酵产品-酪酸菌发酵豆粕。结果表明：该产品具有较强的益生菌价值，产品初始含有＞6×105CFU/g的酪酸菌，且稳定性较好，一年后仍留存＞5×105CFU/g的酪酸菌。此外，该产品与豆粕原料相比，多种常规营养指标得到改善，具体表现为：粗蛋白质提升4.04%，酸溶蛋白质提升12.02%，蛋白质体外消化率提升9.69%，pH降低1.18，L-乳酸增加了2.92%，另外，该产品还可有效去除大分子抗原蛋白与不良寡糖等抗营养因子。

豆粕发酵剂；酪酸菌；常规营养指标；抗原蛋白；不良寡糖

发酵豆粕具有较高的应用价值，主要应用于仔猪料、母猪料、水产饲料等。酪酸菌是新兴的微生态制剂，具有减少腹泻、抑制魏氏梭菌、提高饲料报酬等作用。但高纯度酪酸菌单菌生产工艺较为复杂，应用成本较高，限制了其应用范围。

复合型发酵豆粕是指用两种或两种以上的菌种联合对豆粕进行发酵，它有机结合了各菌种的特点，能对豆粕进行充分有效的发酵。乳酸菌对豆粕进行发酵时产生的大量乳酸，可用于维持畜禽肠道微生物平衡，并能改善发酵豆粕风味，降低豆粕中抗营养因子含量（魏炳栋等，2010）。酪酸菌为绝对厌氧菌，可与兼性厌氧的乳酸菌共生，在固态发酵初始添加酪酸菌，在最终产品中仍有大量活酪酸菌菌体与代谢物质残留，可以起到促进益生菌繁殖、抑制杂菌生长、修复肠黏膜损伤、提高机体免疫力等作用（王润之等，2009等；王保正，2007；施大林，2006）。不同的菌种发酵豆粕所产生的营养价值不同，各有其特有的优良性质，本研究将酪酸菌与豆粕发酵菌共同发酵，旨在生产一种富含酪酸菌的发酵豆粕。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 根源豆粕发酵剂 （GY JY SBM fermentation agent）、酪酸菌菌粉（butyric acid bacteria fungus powder)，菌量1010CFU/g。

1.2 供试豆粕 渤海豆粕。

1.3 酪酸菌发酵豆粕制备 1000 kg豆粕+5 kg根源豆粕发酵剂+200 g酪酸菌菌粉+420 kg水，温度控制在35～40℃，搅拌机内混合均匀后，采用车阵式固态发酵系统，在恒温发酵车间，35°C恒温密封发酵72 h，采用流化床低温烘干，获得富含酪酸菌的发酵豆粕（李慧芬等，2015）。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 酪酸菌菌量测定方法 用胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基 （TSC），采用夹层培养法，进行酪酸菌菌量测定。TSC培养基成分:胰胨15 g/L，大豆胨 5 g/L，酵母粉5 g/L，焦亚硫酸钠1 g/L，柠檬酸铁铵1 g/L，琼脂15 g/L。调节pH至7.6，121℃高压灭菌15min。

先用灭菌TSC培养基分装平皿，37℃恒温培养箱内空培24 h。无菌条件下取1 g酪酸菌发酵豆粕产品，加入含有100 mL灭菌水与灭菌玻璃珠的锥形瓶内，常温搅拌30min，制成1∶100的初始悬浮液。吸取此悬浮液1 mL，加入9 mL灭菌水，充分混合后，制成1∶1000的稀释液，根据含菌量，做进一步的10倍梯度稀释。取适宜梯度的稀释液0.1mL，接种到3个平行的TSC平板上，用灭菌涂布棒涂布均匀，然后再倾注一层灭菌TSC培养基，形成TSC夹层培养。待培养基完全凝固后，将平皿放于含有1个厌氧袋的密封厌氧罐内，37℃完全厌氧培养12h后，计量平皿上的菌落平均数量，并镜检酪酸菌菌体形态。

1.4.2 酪酸菌发酵豆粕中酪酸菌菌量测定 利用TSC培养基，采用夹层培养法，对L-1批次、L-3批次、L-7批次和L-15批次，进行酪酸菌菌量测定。

1.4.3 酪酸菌发酵豆粕中酪酸菌存活率跟踪 用TSC培养基，采用夹层培养法，对L-3批次的酪酸菌发酵豆粕，进行一年的酪酸菌菌量跟踪。跟踪时间点为1月后、2月后、6月后、12月后。

1.4.4酪酸菌发酵豆粕与豆粕原料的常规指标测定 采用国标或企标，对pH、L-乳酸、粗蛋白质、酸溶蛋白（%粗蛋白质）、蛋白质体外消化率等指标进行测定。pH:取10 g样品（精确到0.001 g），加50 mL蒸馏水，混合后静置15 min，用PHS-3C 型pH计测定；L-乳酸:取1 g样品（精确到0.001 g），加100mL水，常温磁力搅拌1 h，10000 r/min离心10min，取上清，利用SBA生物传感器，测定L-乳酸含量；粗蛋白质:按照国标饲料中粗蛋白质测定方法（GBT 6432-94），采用凯氏定氮法测定；酸溶蛋白:按照国标大豆肽粉测定方法（GB/T 22492-2008），采用三氯乙酸TCA-凯氏定氮法测定；蛋白质体外消化率:按照国标动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定（GB/T 17811-2008），采用过滤法测定。所有指标测定3个重复，结果取平均值。

1.4.5 酪酸菌发酵豆粕中抗原蛋白的测定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，对豆粕、酪酸菌发酵豆粕的抗原蛋白进行定性测定（王寅等，2013）。样品粉碎，过60目筛。称取样品0.1 g，加入30 mL 0.6%KOH溶液（质量体积比），常温下磁力搅拌器搅拌1 h，4000 r/min离心10 min，取上清；100μL+100μL上样缓冲液，混匀后煮沸8min，即可点样；20μL上样，恒流15mA，约1 h，进入分离胶后，恒流20 mA，2～2.5 h，蛋白条带至胶底1.2 cm处停止；拨胶并用蒸馏水漂洗；采用考马斯亮蓝染色1.5 h；脱色液更换3次，并过夜；观察条带、照相。

1.4.6 酪酸菌发酵豆粕中不良寡糖的测定 采用薄层分析法（TLC）进行不良寡糖指标测定。采用0.5μm平头微量进样器进行点样。称取粉碎样品5 g（精确到0.001 g）于250 mL碘量瓶，加体积分数为80%的乙醇50mL，70℃水浴浸提1 h以上。浸提液经10000 r/min离心10min，取上清4℃保藏备用。常规的TLC薄层，105℃活化30min，冷却后取5μL点样。点样后，都用电吹风的凉风吹干。TLC板在倒入相应展开剂的展层缸内展开，展开液:V（乙腈）∶V（冰乙酸）∶V（水）=6∶3∶2。溶剂向上展开约90%的薄板长度，取出薄板并且马上用铅笔标注出溶剂前沿，并计算Rf值。自然晾干后，喷淋显色液，在140℃下烘至显色（约2～6 min）。显色液:20%硫酸+0.5%3,5—二羟基甲苯。观察不良寡糖样点并照相。

2 结果及分析

2.1 酪酸菌菌量测定 按照TSC夹层培养法，稀释特定梯度的酪酸菌发酵豆粕检测平板，每个平板生长酪酸菌菌落50～100个，菌落形态如图1，为黑色、边缘整齐、直径较小的圆形菌落。菌体与亚硫酸盐发生反应，可产生臭气硫化氢，焦亚硫酸钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色。菌体镜检如图2，菌体呈梭状，中心膨胀。

2.2 酪酸菌发酵豆粕中酪酸菌菌量测定 多批次酪酸菌发酵豆粕酪酸菌菌量测定结果如图3所示。结果表明，酪酸菌发酵豆粕中，均含有＞6× 105CFU/g的酪酸菌，这些酪酸菌进入动物肠道内，可以降低肠道pH，抑制有害菌生长，提高有益菌菌量，有效预防肠炎发生，并能缓解修复肠黏膜损伤，提高动物机体非特异性免疫力。

2.3 酪酸菌发酵豆粕中酪酸菌存活率跟踪 酪酸菌发酵豆粕L-3批次中酪酸菌存活率跟踪结果如图4所示。结果表明，酪酸菌发酵豆粕L-3批次产品中，最初含有6.45×105CFU/g的酪酸菌，1月后含有89.73%的酪酸菌，半年内含有83.25%的酪酸菌，酪酸菌菌量＞5.3×105CFU/g，1年后仍含有78.97%的酪酸菌，酪酸菌菌量＞5×105CFU/g。

图1 TSC夹层平板上的酪酸菌菌落

图2 酪酸菌镜检图（10×100）

图3 酪酸菌发酵豆粕-多生产批次酪酸菌菌量测定

图4 酪酸菌发酵豆粕L-3批次-酪酸菌存活率跟踪

2.4 酪酸菌发酵豆粕与豆粕原料的常规营养指标差异 酪酸菌发酵豆粕与豆粕原料的常规营养指标差异比较结果如表1所示。结果表明，酪酸菌发酵豆粕相对于豆粕原料而言，各常规营养指标都有所提升，具体表现为:经发酵剂与酪酸菌联合发酵获得的发酵豆粕，具有更低的pH和更高的L-乳酸含量，PH降低了 1.18，L-乳酸增加了2.92%；在蛋白质方面，因微生物的分解作用，酪酸菌发酵豆粕比豆粕原料具有更高的粗蛋白质、酸溶蛋白和蛋白质体外消化率，这几个指标分别提升了4.04%、12.02%、9.69%。

表1 发酵豆粕与豆粕原料的常规营养指标差异比较

2.5 酪酸菌发酵豆粕中抗原蛋白的去除 酪酸菌发酵豆粕与豆粕原料抗原蛋白的SDS-PAGE结果如图5所示。结果表明，豆粕中的抗原蛋白，经根源JY发酵剂与酪酸菌联合发酵后，几乎完全降解为小分子基团，其抗原活性大大降低，抗原蛋白的去除有利于减少动物养殖过程中蛋白质过敏现象的发生（龚灵芝等，2008；于春艳等，2009；李婷琳等，2012）。

图5 酪酸菌发酵豆粕与豆粕原料的SDS-PAGE对比图

2.6 酪酸菌发酵豆粕中不良寡糖的降解 酪酸菌发酵豆粕与豆粕原料不良寡糖的薄层平板TLC结果如图6所示。结果表明，酪酸菌发酵豆粕相对于豆粕原料而言，不良寡糖几乎完全被降解。豆粕原料中，一般含有5%蔗糖，1%棉籽糖和4%水苏糖，其中棉籽糖和水苏糖被称为不良寡糖。不良寡糖又叫胀气因子，这是因为动物体内缺乏α-半乳糖苷酶，不良寡糖进入肠道被微生物利用，转化为挥发性脂肪酸，进而形成CO2，NH3，甚至甲烷，引起动物嗝气、肠鸣等肠胃胀气或腹疼等（曹钰等，2007）。

3 讨论与结论

固态发酵过程中不需添加任何化学试剂，成本较低，且在发酵后没有废水废气等残留，无毒副作用，较安全可靠。微生物发酵豆粕，可消除多种抗营养因子，同时产生微生物蛋白质，丰富并平衡豆粕中的蛋白质营养水平，最终改善豆粕的营养品质，提高蛋白质消化率与饲料转化效率。

图6 酪酸菌发酵豆粕与豆粕原料的不良寡糖薄层平板TLC对比图

酪酸菌作为微生物饲料添加剂的使用，减少了使用抗生素所引起的抗药性、二重感染等问题，提高了动物的自然防御机制和经济效益，已经成为替代抗生素的一种理想选择（魏伟群等，2011）。

根源酪酸菌发酵豆粕，采用根源自主研发的发酵剂与酪酸菌联合固态发酵豆粕而成，含有＞6× 105CFU/g的酪酸菌，且稳定性较好，一年后仍留存＞5×105CFU/g的酪酸菌，具有较强的益生菌价值。此外，该产品与豆粕原料相比，可去除大分子抗原蛋白、棉籽糖与水苏糖等不良寡糖，提高粗蛋白质、酸溶蛋白、体外蛋白质消化率和L-乳酸等有机酸含量，还可显著降低发酵体系pH，这有利于抑制霉菌等杂菌的污染。酪酸菌发酵豆粕作为一种新型的发酵豆粕产品，在降低抗原的基础上，还具有较强的益生价值，可以作为一种添加剂推广使用。

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This study was carried out to prepare a special composite solid-state fermented product-GY Butyric acid bacteria FSBM （fermented soybean meal）.Results showed that GY Butyric acid bacteria FSBM possess strong probiotic value which contain＞6×105CFU/g Butyric acid bacteria initially，and preserve＞5×105CFU/g Butyric acid bacteria one year later.In addition，compared with SBM，the product could improve multiple convention nutritive index，such as crude protein promote 4.04%，acid soluble protein promote 12.02%，protein in vitro digestibility coefficient promote 9.69%，pH reduce 1.18，L-Lactic acid increased by 2.92%，anti nutritional factors within giant molecule antigen protein and harmful oligosaccharide were removed effectively.

JY SBM fermentation agent；Butyric acid bacteria；convention nutritive index；antigen protein；harmful oligosaccharide

S816.6

A

1004-3314（2016）23-0036-04