张爱春，周 存，2

（1.天津工业大学 材料科学与工程学院，天津 300160；2.天津纺织纤维界面处理工程中心，天津 300160）

DNA电化学生物传感器的研究进展

张爱春1，周 存1，2

（1.天津工业大学 材料科学与工程学院，天津 300160；2.天津纺织纤维界面处理工程中心，天津 300160）

介绍了DNA电化学生物传感器的组成及原理，综述了近年来单链DNA的固定以及杂交信号的电化学检测方面的研究进展，探讨了纳米材料、纳米技术在DNA电化学生物传感器的制备及应用中发挥的作用，并对DNA电化学生物传感器的发展方向进行了展望.

DNA电化学生物传感器；修饰电极；杂交；纳米材料

当今，在临床、法医学、药学领域的应用中实现在低浓度下对特定序列的DNA快速、简单的检测是十分重要的[1].基于电化学检测方法的DNA电化学生物传感器由于简单、快速、无毒、成本低、灵敏度高和可用于活体检测等优势引起了广泛的关注[2-3].DNA电化学生物传感器是从20世纪90年代中期逐渐发展起来的一种新的传感器技术，它的基本结构包括一个能固定DNA探针的电极和一个换能器[4]，通过在电极表面杂交反应选择性的识别DNA片段.纳米材料由于比表面积大、生物活性中心多、表面原子配位不全、吸附能力强且具有无毒副作用、良好的生物相容性、耐腐蚀等优异的性能[5-6]，为DNA电化学生物传感器的研究提供了新的途径.本文在介绍DNA电化学生物传感器设计原理的基础上阐述了近年来在DNA固定方面以及杂交信号的电化学检测方面的研究进展，着重分析了纳米材料在DNA电化学生物传感器构建中发挥的独特作用，并对其发展方向进行了展望.

1 DNA电化学生物传感器的设计

DNA电化学生物传感器的工作原理[7-8]是将ssDNA作为敏感元件固定在固体电极表面，加入具有电活性的物质作为杂交指示剂，通过检测修饰电极在待测溶液中电化学信号的变化，以确定靶DNA序列；或者将待测基因片段固定在电极表面，然后与溶液中的已标定杂交指示剂的DNA探针进行杂交，来检测待测基因序列.

具体来说，DNA电化学生物传感器测定DNA包括4个过程，如图1所示.①DNA探针的固定，即要将ssDNA固定到电极表面，形成DNA探针修饰电极.②杂交过程，将DNA探针电极放入与之互补的cssDNA被测溶液中，两者在电极表面杂交形成dsDNA，这一过程必须控制合适的杂交条件，如杂交温度、DNA固定液pH值、杂交时间等.③杂交的指示，也就是如何将杂交信号转化为可测定的电化学信号.④电化学信号的检测，一般将电流、电压或电导作为检测信号.

图1 DNA电化学生物传感器工作原理图Fig.1 Principle of DNA electrochemical biosensor

1.1 单链DNA在电极表面的固定

DNA探针在电极表面的固定是DNA电化学生物传感器制作中的首要问题[9].要解决这个问题，选择合适的探针是非常重要的.根据实践经验，在选择DNA探针时应遵循以下4个原则：①探针长度为18～50个碱基，过长会导致杂交时间长、杂交效率低，而过短会缺少杂交的特异性.②G、C碱基的组成比例在40%～60%之间，否则会导致非特异性杂交增加.③在探针分子内不能存在互补区，否则会导致“发卡”现象，抑制探针杂交.④尽量避免在探针序列中连续出现一个碱基多次重复（其长度＞4）如GGGGG等.为了把DNA牢固连接在电极表面，往往需要借助以下有效的物理或化学方法：

（1）吸附法.主要是利用DNA片段中带负电的磷酸骨架与带正电的固体基质表面的静电相互作用而将DNA固定在支持物上的，可直接[10]或恒电位[11]将ssDNA吸附于基底电极表面.另外，电极表面沉积纳米颗粒后可提高DNA的固定量.Zhu等[12]在金电极表面电沉积一层纳米二氧化锆，利用其与磷酸残基的特异性结合固定DNA.Zhang等[13]在金电极上自组装半胱氨酸后固定硅烷基化的纳米二氧化硅，然后再将DNA修饰到电极上.

（2）共价键合法.通过DNA端部的修饰官能团与电极表面的修饰物形成共价键合作用，如酰胺键、酯键、醚键等.由于碳质电极表面易于引入各种官能团，所以大多采用碳质电极作为基底电极.Li等[3]发明了一种制备DNA电化学传感器的新方法，他们将NH2-ssDNA探针共价键合到电极表面自组装了4-ATP单分子层的金电极上，取得了理想效果.张怀等[14]利用单壁碳纳米管（SWNTs）上的羧基与DNA末端的氨基形成酰胺共价键从而共价修饰SWNTs，制备了新型DNA共价修饰SWNTs电极，并对其性能做了研究.

（3）自组装法.由于金电极与巯基之间有很强的共价键和作用，并能与氨基发生静电作用，所以自组装法一般以金电极为基体电极.基于分子自组装作用，巯基化合物和氨基化合物可在金电极表面形成高度有序的单分子自组装膜（SAM）[15-17]，再利用SAM的活性基团固定ssDNA.实际应用中还可以通过在DNA片段的一端修饰巯基或氨基利用自组装作用将其固定到金电极上[18-19].和裸金电极相比，HS-DNA更容易结合在金溶胶上，因此金溶胶可以提高电极表面探针DNA的密度，图2是在金电极表面固定纳米金后以自组装法固定DNA的示意图.

图2 金电极上自组装法固定DNA示意图Fig.2 Schematic diagram of DNA immobilization on gold electrode by self-assembly mothod

赵红秋等[20]利用双硫醇分子作联接剂，将金纳米粒子固定在金片上，在实验条件下，经过纳米金颗粒修饰的金片对HS-DNA探针的吸附量比未经修饰的金片可提高3～5倍.Herne等[21]发现HS-DNA与巯基己酸混合固定可消除金电极表面DNA的非特异型吸附，同时发现离子强度对HS-DNA在金表面的覆盖率起决定作用，高离子强度条件下，金电极表面HSDNA覆盖率高.

（4）生物素-亲和素法.生物素与亲和素的结合具有专一、迅速和稳定（kD=1015）的特点,用生物素-亲和素法固定DNA时，一般是先将亲和素通过共价偶联或静电作用连接于电极表面，再利用生物素与亲和素之间极强的专一亲和作用将生物素修饰的DNA固定在固体支持物上.Ebersole[22]首先把亲和素接到石墨电极上，然后再固定被生物素衍生化的DNA探针. Cai等[23]使含有亲和素的7-羟基-6-甲氧基香豆素在氧化铟锡电极上电聚合，把亲和素包埋在聚合物膜内，固定修饰有生物素的ssDNA.

（5）聚合物膜法.可以综合利用共价键合法和吸附法将DNA固定于膜内，进而对电极进行修饰.用聚合物膜修饰电极时，可将聚合物溶液在电极表面上滴涂制备，也可由含氧化还原的单体在电极表面上电化学聚合成膜.目前最为常见的是电化学聚合电子导电型聚合物膜.蔡军等[24]以铂电极上聚合的2，6-吡啶二甲酸（PDC）膜组装G5.0树状高分子（PAMAM）固定ssDNA探针，并用[Fe（CN）6]3-/4-作氧化还原指示剂，以电化学交流阻抗和循环伏安技术对探针ssDNA的固定和杂交进行了表征，实验结果表明，当ssDNA在复合膜上固定及与其互补序列杂交后，电极表面的传递电阻（Ret）依次增大.

1.2 DNA杂交的电化学转换

DNA电化学生物传感器通过检测电化学信号指示杂交情况从而实现对特定序列DNA的检测，根据是否需要电化学指示剂可将检测方法分为直接检测和间接检测两大类.

1.2.1 电化学信号的直接检测

直接检测法是指直接检测由杂交行为引起的自身电信号的改变.最常用的是DNA碱基中的鸟嘌呤（G）[25]，它具有电化学活性，很容易发生氧化反应，杂交后由于dsDNA双螺旋外侧的脱氧核糖阻碍内侧碱基的电化学反应，导致G的电化学氧化信号下降，因此，可以用G的电信号的变化直接检测DNA杂交.Wang等[26]用固定dsDNA的微型电化学传感器，基于DNA中鸟嘌呤的氧化信号变化探讨了紫外光辐射引起的DNA损伤，包括DNA的构象变化及其鸟嘌呤的光致化学反应.张钱丽等[27]以活化微碳圆盘电极为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，研究了鸟嘌呤的电化学行为，实验结果表明：在pH=8.20的Britton-Robinson（BR）缓冲溶液中，鸟嘌呤在0.780 V有一氧化峰，工作电极在1.0 mol/L的NaOH溶液中活化5 min后，鸟嘌呤的氧化电流响应明显提高，氧化峰电流和鸟嘌呤浓度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范围内呈现良好的线性关系，检测限为6.0×10-8mol/L.

1.2.2 基于指示剂的间接检测

（1）非标记型杂交指示剂作为识别物.杂交指示剂是指能与ssDNA和dsDNA以不同非共价方式相互作用的电化学活性化合物，基于其与ssDNA和dsDNA选择性结合能力的差异达到指示DNA的杂交是否发生和发生程度的目的.一般来说，双链DNA与指示剂的相互作用为静电作用和内部疏水作用,而单链DNA主要是静电作用.常用的杂交指示剂有亚甲基蓝[28]、Co（phen）32+[29]、[Fe（CN）6]3-/4-[18]等.

（2）标记型杂交指示剂作为识别物.标记了电活性杂交指示剂的核苷酸与电极表面的靶基因选择性地进行杂交反应，在电极表面形成带有电活性官能团的杂交分子，通过测定其电信号可以识别和检测DNA分子.徐春等[30]以EDC为偶联活化剂，利用缩合反应，分别将电化学活性物质氨基二茂铁（AFC）和醛基二茂铁（FCA）成功的标记在变性小牛胸腺DNA片段上，制备成了二茂铁标记DNA探针.Zhu[31]合成了一种表面有自由羧基的硫化铅的纳米粒子，然后将它作为标记物接到一段已知序列的寡核苷酸上，将这个合成物充当探针与固定在聚吡咯膜中的靶基因进行杂交，采用阳极溶出伏安法检测由于杂交而使硫化铅氧化溶解出的铅离子，从而判定杂交是否成功，检测限达到0.3 mol/L.

2 纳米材料在DNA电化学生物传感器制备中的应用

纳米材料所具有的表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应使其在力学、电学、磁学、热学、光学以及化学活性等方面都表现出特殊的性质.在DNA电化学生物传感器领域引入纳米材料主要起到以下几种作用：

（1）加速电子传递.许多纳米材料如碳纳米管[32]和金属纳米粒子[33]等都具有良好的导电性能，将其作为导线连在生物分子与电极之间，既能起到加快异相界面电子传递速率的作用（宏观量子隧道效应），又能增加氧化还原物质在电极表面反应的可逆性，是优良的电极修饰材料.纳米复合颗粒比单一纳米颗粒更易于形成连续势场，提高电子迁移速率，所以复合纳米颗粒在增强传感器的电流响应、提高灵敏度方面性能更优异.Cai等[34]合成了一种新的Cu@Au核壳型纳米粒子，并将其通过5′-烷基硫醇标记到核苷酸上制备成纳米标记的寡聚核苷酸探针，然后与通过静电吸附作用吸附在聚吡咯修饰的玻碳电极表面的目标基因片段杂交，将标记物中的纳米粒子溶解后用高灵敏的阳极溶出伏安法测定，检测大肠杆菌毒素目标基因的下限为5.0 pmol/L.

（2）作为固定载体增加ssDNA在电极表面的吸附量.纳米材料因具有比表面积大、表面自由能高、生物相容性好等特性，使DNA探针在其表面的吸附量得到很大程度提高，并较好的保持其生物构型及活性.杨婕[35]在玻碳电极（GCE）上电聚合2，6-吡啶二甲酸（PDC），采用电沉积和浸泡结合法将纳米金（NG）修饰在PDC/GCE膜上制备NG/PDC/GCE电极，并将DNA探针固定在NG/PDC/GCE电极上，分别以亚甲基蓝为指示剂的循环伏安法和在[Fe（CN）6]3-/4中的交流阻抗谱技术对DNA的固定和杂交进行了表征，结果表明纳米金修饰于聚2，6-吡啶二甲酸膜上可大大提高DNA探针的固定量.Liu等[36]直接在金电极上于-200 mV单电位模式下电沉积含0.1 mol/L KNO3的HAuCl4溶液，制备成纳米金粒子金电极，以亚甲基蓝为电化学指示剂采用循环伏安法表征了DNA的固定与杂交，发现DNA的固定与杂交量大大提高，灵敏度显著提高.

（3）作为电化学标记物增强和放大电信号.通常用于DNA电化学分析的纳米标记粒子主要有金属纳米粒子和半导体纳米粒子.许多文献报道了胶体金在DNA电化学生物传感器中的信号放大作用，并在此基础上发展了金标银染法.蔡宏[37]将纳米金胶标记于人工合成的5′-端疏基修饰的寡聚核苷酸片段上，制备成具有电化学活性的金胶标记DNA电化学探针，然后利用壳聚糖和寡聚核苷酸之间的静电作用将要检测的寡聚核苷酸固定于壳聚糖修饰的玻碳电极上，用差分脉冲伏安法对杂交效果进行了检测，结果表明：基于纳米金标记的DNA探针电化学传感器有较强的序列选择性.他进而用金标银染技术对大肠杆菌肠毒素基因片段进行了检测，由于银颗粒的氧化还原电信号较强，银染后，杂交信号被放大了近2个数量级.另外，值得一提的是磁性纳米粒子[38]由于其优异的磁性能也被用于标记识别因子，这给医学的发展提供了空间，比如在肿瘤检测中，将纳米磁性颗粒与肿瘤表面的靶标识别器结合后，可在体外测定磁性颗粒在体内的分布和位置，从而给肿瘤定位.

3 结束语

DNA电化学生物传感器的研究工作开辟了电化学与分子生物学的新领域，为生命科学的研究提供了一种全新的方法.目前，国内的研究还处于起步阶段.近年来，纳米颗粒应用于DNA电化学生物传感器已经取得了很大进步，但目前所使用的纳米颗粒的种类很有限，针对纳米生物材料的生物功能化的研究尚不深入.为进一步提高DNA电化学生物传感器的灵敏度和响应电流，在纳米材料制备方法的改性、各种形式的有机或无机纳米材料的应用以及基底电极的开发及修饰等方面仍有较大的发展空间.在DNA片段的修饰方面，研究工作也主要集中在寡聚核苷酸的5′-端进行巯基修饰形成巯基化寡聚核苷酸探针，然后再与纳米金结合，这也有待科学工作者进行更深入的研究，探索新的探针修饰手段.在电信号的检测方面，也需要不断开发新的杂交指示剂，实现对特定DNA序列的检测.

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Progresses of DNA electrochemical biosensor

ZHANG Ai-chun1，ZHOU Cun1，2
（1.School of Material Science and Processing Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300160，China；2. Tianjin Textile Fiber Interfacial Processing Engineering Center，Tianjin 300160，China）

The constitution and principle of DNA electrochemical biosensor are introduced，and the research progress in recent years about the immobilization of single strand DNA and the electrochemical detection of hybridization signal is reviewed，the specific effect of nano materials and nano technology in DNA electrochemical biosensor is also expounded.A prospect for the future development in this field is given briefly.

DNA eletrochemical biosensor；modified electrode；hybridization；nano materials

book=3,ebook=87

TP212.3

A

1671－024X（2010）03－0066－05

2010-01-06

张爱春（1986—），女，硕士研究生.

周 存（1972—），男，副研究员，硕士生导师.E-mail:zhoucun@tjpu.edu.cn