孙庆兰，张 华，张西正，郭 勇，李瑞欣，战 锐

（1.天津工业大学 理学院，天津 300160；2.军事医学科学院 卫生装备研究所，天津 300161；3.军事医学科学院 卫生学环境医学研究所，天津 300050）

内皮细胞与小肠黏膜下层细胞相容性的初步研究

孙庆兰1，张 华1，张西正2，郭 勇2，李瑞欣2，战 锐3

（1.天津工业大学 理学院，天津 300160；2.军事医学科学院 卫生装备研究所，天津 300161；3.军事医学科学院 卫生学环境医学研究所，天津 300050）

通过盐溶液溶胀和酶液消化制备小肠黏膜下层基质作为血管组织工程支架材料，将大鼠内皮细胞接种于支架材料上，测定小肠黏膜下层基质的细胞相容性.实验结果表明：内皮细胞在小肠黏膜下层基质上迅速铺展增殖生长，在4 h时大约有96%的细胞黏附于材料上，MTT法结果表明内皮细胞在支架上增殖生长明显，活细胞形态学观察表明细胞在支架材料上生长良好.

小肠黏膜下层；支架；内皮细胞；组织工程

目前对血管移植物的需求不断增大，组织工程方法可以较好地解决此问题[1].支架材料作为活细胞在体外生长时的支持物，在组织工程中占据很重要的位置.组织工程血管支架材料应具有良好的生物相容性，不易形成血栓等[2].30多年前有学者提出把小肠黏膜下层基质（Small intestinal submucosa，SIS）作为血管支架材料[3].小肠黏膜下层是一种优良的天然生物材料，来源广泛，并且还具有良好的力学性能[4].虽然很多研究者都把SIS作为良好的组织工程血管材料，但是血管种子细胞和SIS的复合情况却少有研究.本文采用处理过的SIS做支架，再种植血管内皮细胞，测定细胞与材料的复合情况，并作相关的形态学观察，可以为组织工程血管研究的发展提供有价值的实验资料.

1 实验部分

1.1 主要材料和设备

试验动物采用清洁级Wistar大鼠，雌雄不拘，体重150～180 g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供.

所用试剂包括：DMEM培养液，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；胰蛋白液，美国GIBCO公司产品；凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒，武汉博士德公司产品；MTT，联星生物公司产品.

所用仪器包括：超净台，苏州净化设备公司产品；倒置显微镜，日本Olympus产品；5%CO2培养箱，美国Forma公司产品.

1.2 内皮细胞培养

断颈法处死Wistar大鼠，无菌条件下快速取出胸段主动脉放置于盛有D-hank′s的培养皿中；用镊子去掉血管表面结缔组织和脂肪组织，将血管纵行剖开，用剪刀将血管剪成1 mm3左右，将血管内膜面贴于鼠尾胶原包被好的培养瓶内[5]；加入2～3 mL含20%FBS的DMEM培养液，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养；翻转干涸3～4 h后，轻轻翻转平放，静置培养.6～7 d左右时去除组织块并换液培养，以后每隔3 d换液1次.当细胞达到80%融合时，用0.25%胰蛋白酶进行消化，以1∶2或1∶3的比例传代，以获得足够量的种子细胞.取3～8代细胞进行实验.

1.3 SIS制备

将新鲜的猪小肠用清水反复冲洗后，用裹有纱布的刀柄去除外面的浆膜层和肌层，翻转后，去除黏膜层.经50 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH处理16 h后，再用去离子水冲洗干净.再经1 mmol/L NaCl和1 mmol/L HCl处理8 h[6]，去离子水反复冲洗.1 mmol/L NaCl磷酸缓冲液处理16 h.0.25%胰酶和0.5%SDS分别处理24 h，去离子水冲洗.PBS浸洗6～8 h，0.3% H2O2浸泡6～8 h，去离子水浸洗4～6 h，冻干，置于-20℃温度下保存.

1.4 内皮细胞与SIS材料表面黏附情况测定

将处理过的小肠黏膜下层处理成24孔板大小，铺于孔板内，经紫外线照射灭菌后待用.将大鼠内皮细胞消化成2.5×105个/mL，吸取100 μL加入各孔，分别在种植细胞1、2、4 h时，加入900 μL D-hank′s，轻轻吹打后取上清液用血球计数板进行计数，进而得到细胞贴壁数目.

1.5 MTT法测定内皮细胞在SIS上的增殖情况

将处理过的小肠黏膜下层（SIS）处理成24孔板大小，并将其平整铺于孔板内，经紫外线照射灭菌后待用.将大鼠内皮细胞消化成4.5×105个/mL的细胞悬液，接种于24孔板内，每孔接种200 μL，置于37℃、5%CO2培养箱内培养.于第1、3、5、7 d各取出1块培养板，将接种有内皮细胞的材料取出放入空白板内，沿侧壁缓缓加入含10%胎牛血清的DMEM培养液400 μL；然后加入100 μL的MTT（2 mg/mL），继续培养4～6 h；然后小心吸出孔内液体，每孔加入450 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min；将液体吸出，按每孔150 μL加入到96孔板内，用酶标仪在490 nm处测定OD值.

2 结果与讨论

2.1 SIS观察

经过盐溶液溶胀和酶液消化法、PBS振荡洗涤等步骤后制备成脱细胞小肠黏膜下层基质.支架材料行HE染色，见图1（a），观察得到支架材料脱细胞完全，无细胞或细胞碎片残留，而图1中（b）观察得到SIS胶原保存良好.

图1 小肠黏膜下层（SIS）光学显微镜照片Fig.1 Optical microscope image of small intestinal submucosa

2.2 内皮细胞与SIS材料表面黏附情况测定

虽然种子细胞的种植有多种方法，但是由于内皮细胞是单层生长细胞，并且存在小肠黏膜下层基质在溶液较多的情况下会漂浮起来等原因，为了保证细胞能够最大程度地黏附于材料上，采用细胞计数的方法测定了细胞与支架材料黏附的最佳时间，测定结果如表1所示.

表1 内皮细胞与SIS粘附率测定Tab.1 Rate of adhesion about ECs and SIS

由表1可见，内皮细胞在1 h时贴壁数目就很多，达到了2.0×104个（共2.5×104个/孔），可见内皮细胞在短时间内就能很好地贴壁.在2 h和4 h时贴壁细胞数目都有相应的增加，4 h时细胞黏附率达到96%左右.若在此时再补加培养液，细胞不会因为浮力的作用而漂浮于培养液中，以致于难以贴壁生长.

2.3 MTT法测定内皮细胞在SIS上的增殖

由于细胞计数法误差很大，而通过MTT法测定细胞增殖情况，是目前为止使用较广和比较可靠的方法之一.活细胞中的线粒体脱氢酶能将染料MTT转变为不可溶性的紫色甲瓒颗粒，二甲基亚砜可溶解甲瓒颗粒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量.而在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比.图2所示分别为在第1、3、5、7 d时，以9×104/24孔板的密度种植在处理过的SIS材料表面的细胞MTT数值.

图2 MTT法测定内皮细胞在SIS上增值情况Fig.2 Proliferation of ECs on SIS by MTT methods

由图2可以得出细胞增殖情况的趋势，即随着时间的延长而按成比例的增加.在第7 d时数值仍有所增加，说明在第7 d时细胞并未因长满而出现生长停滞或者凋亡的现象.

图3为在不同时间，EC与SIS支架材料复合过程中细胞形态学观察情况.

由图3可以看出，血管内皮细胞与SIS基质复合的过程中，大鼠内皮细胞在刚种植时，细胞多呈现出圆形状；随着时间的延长，细胞逐渐在材料上延伸生长并增殖，呈现多角形，开始伸出伪足；第1 d时多数细胞在支架材料上铺展开，呈现不规则的形状；第3 d时细胞已经开始增殖；第5 d时内皮细胞大量增殖，内皮细胞在材料上生长良好，材料上有多个细胞密集区，表现出“鹅卵石”样排列；第7 d时细胞生长良好，细胞分布比较均匀，铺满整个材料表面.

图4所示为内皮细胞种植支架材料后第5 d时的扫描电镜照片.

由图4可以看出，此时，内皮细胞分泌的细胞外基质已经粘连在一起，形成一定的网络结构.由于小肠黏膜下层是天然的生物材料，含有生物信息，能够提供细胞所需的信号，推测其上所含有的部分生长因子能促进内皮细胞在支架材料上的黏附与增殖.

图3 EC与SIS材料复合过程中细胞形态学检测Fig.3 Cell morphology test of adhesion to ECs on SIS after implanted

图4 组织工程化血管的扫描电镜观察Fig.4 SEM micrographs of tissue engineering blood vessels

3 结论

本实验采用盐溶液和胰酶共同处理得到脱细胞小肠黏膜下层，细胞去除完全，纤维保存良好.大鼠内皮细胞在SIS上黏附生长良好，说明SIS具有良好的细胞相容性，能够促进血管种子细胞在其上的黏附和增殖，可作为组织工程血管的支架材料.

参考文献：

[1]张 炎，刘太华，姜宗来，等.全生物化组织工程血管构建的初步研究 [J].生物医学工程学杂志，2005，22（3）：448-451.

[2]ISENBERG B C，WILLIAMS C，TRANQUILLO R T.Smalldiameter artificial arteries engineered in vitro[J].Circ Res，2006，98（1）：25-35.

[3]CAMPOCCIA D，DOHERTY P，RADICEM，et al.Semisynthetic resorbable materials from hyaluronan ester ification[J]. Biomaterials，1998，19（23）：2101-2127.

[4]郭 勇，张西正，李瑞欣，等.小肠黏膜下层的制备及其在心肌组织工程中的应用[J].解放军医学杂志，2008，33（11）：1304-1306.

[5]潘礼龙，戴 敏，王 伟.大鼠主动脉内皮细胞原代培养的研究[J].中国药理学通报，2007，23（3）：410-413.

[6]韩本松，范存义，刘生和，等.不同应力环境对组织工程血管形成的影响 [J].中国修复重建外科杂志，2007，21（3）：302-306.

Primary research on cytocompatibility of endothelial cells and small intestinal submucosa

SUN Qing-lan1，ZHANG Hua1，ZHANG Xi-zheng2，GUO Yong2，LI Rui-xin2，ZHAN Rui3
（1.School of Science，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300160，China；2.Institute of Medical Equipment，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300161，China；3.Institute of Hygiene and Environmental Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300050，China）

As the scaffolds of the vascular tissue engineering，the small intestinal submucosas matrix are obtained by salt solution swelling and enzyme digestion，and vascular endothelial cells are isolated from the rat thoracic aorta and subcultureed and purified.The ECs are seeded on the surface of scaffolds to determine whether the scaffolds had the cytocompatibility.Experimental results show that the seeded endothelial cells proliferate rapidly on the small intestinal submucosa matrix.About 96%of the cells adhere to the surface of the material in the 4 hours after being seeded，and the Ecs grow obviously on scaffolds by the MTT method.The morphological observation of cells shows that cells grow well on the scaffold materials.

small intestinal submucosa；scaffolds；endothelial cells；tissue engineering

book=3,ebook=96

R318.08

A

1671－024X（2010）03－0071－03

2009-09-28 基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（2005CB623904）

孙庆兰（1985—），女，硕士研究生.

张 华（1961—），女，教授，导师.E-mail：hua1210@126.com