王晓岚, 王璇,, 张连富

(1.江南大学医药学院,江苏无锡 214122;2.江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

番茄红素纳米分散体抗小鼠肝移植瘤的作用

王晓岚1, 王璇1,2, 张连富2

(1.江南大学医药学院,江苏无锡 214122;2.江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

为了研究番茄红素纳米分散体对肿瘤生长的影响及其机制,采用乳化-蒸发工艺(超声乳化)制备了番茄红素纳米分散体并用小鼠移植型肝癌模型研究了番茄红素纳米分散体的体内抗肿瘤作用和对机体抗氧化、抗增殖能力的影响。采用乳化-蒸发工艺(超声乳化)可获得纳米级别的番茄红素分散体系;番茄红素纳米分散体以1.95 mg/kg,3.9 mg/kg剂量给移植型肝癌H22小鼠用药10 d后,移植瘤生长抑制率分别为32.37%,54.34%;同时可提高小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,降低丙二醛(MDA)含量;可提高小鼠肝组织总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低过氧化氢(H2O2)、MDA含量;下调增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达。研究表明,番茄红素纳米分散体在体内能明显抑制移植瘤的生长,其机制可能与提高机体的抗氧化活性、抑制肿瘤细胞增殖有关。

番茄红素;纳米分散体;抗肿瘤作用;抗氧化活性;增殖细胞核抗原

番茄红素(Lycopene)是一种重要的类胡萝卜素,研究表明番茄红素具有多种生理功能,如抗氧化、防癌抗癌、提高免疫能力、抗衰老、抗炎症、抗凝血等[1-2],但由于番茄红素是脂溶性色素,限制了其使用范围。利用纳米技术可有效改善难溶性组分的水溶性及贮藏稳定性,并有可能提高其生物利用率,影响其生理功能[3]。关于纳米级别番茄红素的抗肿瘤作用研究尚未见报道。作者参照乳化-蒸发工艺[3-4](超声乳化)制备了番茄红素纳米分散体,在此基础上比较番茄红素纳米分散体和脂溶番茄红素对移植型小鼠肝癌H22的作用,并比较其抗氧化能力和抗增殖能力,以探讨番茄红素纳米分散体对肿瘤的作用及其可能机制,旨在为番茄红素纳米分散体的研究与开发利用积累有价值的资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂 质量分数10%番茄红素粉:华北制药股份有限公司产品;乙酸乙酯、Tween-20:国药集团化学试剂有限公司产品;氟尿嘧啶注射液:南通精华制药有限公司产品,批号:071201;大豆油:中粮食品销售有限公司;总抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所产品。小鼠增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化全套试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.1.2 实验仪器 VCX500超声破碎仪: SONICS&MATERIALS.INC产品;R-205旋转蒸发器:上海申顺生物科技有限公司产品;Nano ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪:Malvern Instruments,U K产品;2100型&UV-2100型分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司产品;电热恒温水浴锅:上海精宏实验设备有限公司产品。

1.1.3 实验动物与细胞株 H22腹水瘤小鼠,购自上海医药工业研究院。

ICR小鼠,健康,雌性,体质量18～22 g,购于扬州大学比较医学中心,许可证号:SCXK(苏) 2007-0001。

1.2 实验方法

1.2.1 番茄红素纳米分散体样品的制备 番茄红素粉溶解于乙酸乙酯中,恒温(50℃)缓慢滴加至含有定量Tween-20的水中。滴加完后以1 000 r/ min搅拌1 h,过滤,超声破碎(冰浴,500 W,1.0～1.0秒/次,3 min)。最后减压旋转蒸发(50℃, 0.1MPa)以除去有机溶剂。所得样品置于棕色玻璃瓶内于4℃保存[3]。

1.2.2 空白乳化剂样品的制备 含有定量Tween-20的水,以1 000 r/min搅拌1 h,过滤,超声破碎(冰浴,500W,1.0～1.0脉冲,3min)。所得样品置于棕色玻璃瓶内于4℃保存。

1.2.3 脂溶番茄红素样品的制备 番茄红素粉使用时以大豆油稀释至所需浓度。

1.2.4 番茄红素纳米分散体粒径的测定 采用激光光散射-Zeta电位分析仪对样品的粒径进行检测,记录Z-均粒径和粒径分布情况(多分散指数PDI)。

1.2.5 抗肿瘤实验 无菌条件下,抽取接种传代7 d的H22肝癌小鼠的腹水,用生理盐水1:3稀释混匀后,每只动物右前肢腋窝皮下注射0.2 mL。然后随机分为5组:空白对照组、1.95 mg/kg分散体组、3.9 mg/kg分散体组、3.9mg/kg脂溶组、阳性对照组,每组10只。以灌胃量为0.2 mL/10g,空白对照组每鼠每天灌胃空白乳化剂样品一次;1.95 mg/kg分散体组、3.9 mg/kg分散体组每鼠每天灌胃相应剂量的番茄红素纳米分散体样品;脂溶组每鼠每天灌胃3.9 mg/kg脂溶番茄红素一次,连续10 d。阳性对照组每鼠每天腹腔注射25 mg/kg氟尿嘧啶注射液一次,连续10 d。给药期间,每日观察小鼠的一般活动、皮毛和粪便等情况。第11 d处死动物,分离瘤块称质量,计算抑瘤率:抑瘤率(%)=(空白组平均瘤重-给药组平均瘤质量)/空白组平均瘤质量×100%。

1.2.6 抗氧化实验 动物分组、给药同上。第11 d处死动物,取血清及制备肝匀浆测定相关指标。血清T-AOC、SOD、GSH-Px活性,MDA含量及肝匀浆T-AOC、SOD活性,MDA、H2O2含量测定:均按试剂盒说明书操作。

1.2.7 免疫组化实验 留取适量瘤组织标本, 10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,石蜡切片脱蜡至水,按试剂盒说明书检测瘤组织的增值细胞核抗原(PCNA)表达。显微镜下观察,细胞核内出现棕黄色颗粒者为PCNA阳性细胞,选取阳性率较高的5个视野,每个视野计数100个瘤细胞,PCNA阳性细胞取均值,作为阳性表达的百分率。

1.3 统计学分析

数据以均数±标准差表示,显著性检验采用SPSS16.0的单因素方差分析进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 番茄红素纳米分散体样品的粒径大小和分布

肉眼观察,番茄红素纳米分散体在水中分散均一,呈现明亮的红色,没有絮状、颗粒状的沉淀,样品在4℃冷藏1个月后仍然澄清透明,无沉淀物,分散性较好;而脂溶的番茄红素分布不均匀,且明显可见大量颗粒沉淀在容器底部。所得结果如图1所示,Z-均粒径是根据信号检测的相关曲线计算得到的,可以较直观地反映体系中粒径的变化,番茄红素纳米分散体样品呈二峰分布,Z-均粒径为261 nm,PDI(粒径分布曲线的分布宽度指数)为多分散性指数,即粒径分布曲线的分布宽度指数,根据信号检测的相关曲线计算得到,代表粒径分布中的非均匀量,)较小,等于0.213,说明粒径大小较均匀,其中峰1的粒径为293.7 nm,强度为98.78%,宽度为107.4 nm,峰2的粒径为5 251 nm,强度为1.217%,宽度为440.8 nm。表明采用乳化-蒸发工艺(超声乳化)可以有效改善难溶性番茄红素在水中的分散。

对于金属与无机物,通常将粒径在1～100 nm范围的颗粒称为纳米粒;对于有机物和聚合物,习惯上将粒径小于1 000 nm的颗粒称为纳米粒[5]。因此,所制备的番茄红素样品属于纳米分散体系。

图1 番茄红素纳米分散体粒径分布图Fig.1 Particle distribution of lycopene narodispersion

2.2 对移植型小鼠肝癌H22的抑瘤作用

空白对照组小鼠接种瘤后活动度降低,毛色较接种前差,最早出现小鼠死亡。给予脂溶番茄红素的小鼠亦活动度降低,毛色也较接种前差。给予番茄红素纳米分散体样品的各组小鼠皮毛光滑,活动无异常。腹腔注射氟尿嘧啶注射液的小鼠出现松毛且腹泻。抑瘤率实验结果如表1所示,与空白对照组相比,3.9 mg/kg番茄红素纳米分散体对移植型小鼠肝癌H22具有明显的抑制作用(P<0.05),抑瘤率达到53.34%。但1.95 mg/kg番茄红素纳米分散体对移植型小鼠肝癌抑瘤率仅为32.37%, 3.9 mg/kg脂溶番茄红素对移植型小鼠肝癌H22的抑瘤率仅27.75%,两组抑瘤作用与空白对照组差异均无显著性意义。有学者报道20 mg/kg脂溶番茄红素可有效抑制裸小鼠移植性肝癌肺转移,与其抑制肿瘤的入侵、增殖及血管新生有关,而1 mg/kg脂溶番茄红素效果不明显[6]。这提示3.9 mg/kg脂溶番茄红素剂量较小,尚不能取得有效的抗肿瘤作用,而纳米化后同样剂量番茄红素可以有效地抑制肿瘤生长,体现了纳米分散体制剂的优势;1.95 mg/kg番茄红素纳米分散体尚不能有效抑制肿瘤生长,也属剂量偏小,3.9 mg/kg可能是取得抑瘤效果的较低剂量。阳性对照药抑瘤率高达70.52%,比其他受试样品的抑瘤效果好,但从表中同样可以看出荷瘤小鼠存活数最少,且小鼠毛发稀疏而精神萎靡,可能与化疗药物的毒副作用有关。

表1 对小鼠移植型肝癌H22的抑瘤作用Tab.1 The tumor growth inhibition on mice transplanted with hepatoma H22

2.3 对移植型肝癌H22小鼠血清酶活性、MDA含量的影响

如表2所示,与空白对照组小鼠相比,给番茄红素纳米分散体样品的小鼠血清中GSH-Px活性都明显升高,MDA含量都明显下降,其中给3.9mg/kg剂量的小鼠改变更明显(P<0.01);在相同剂量下,给予番茄红素纳米分散体样品的小鼠血清T-AOC、SOD、GSH-Px活性都比给予脂溶番茄红素的升高,MDA含量下降,但差异无显著性意义。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶,GSH-Px活力的高低可以间接反映机体清除氧自由基的能力;MDA的量反映机体内脂质过氧化的程度,可以间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。上述实验结果初步说明番茄红素纳米分散体具有明显的抗氧化作用。

表2 移植型肝癌H22小鼠血清的抗氧化活性变化Tab.2 Changes of antioxidant activity of the serum of mice transplanted with hepatoma H22

2.4 对移植型肝癌H22小鼠肝组织酶活性、H2O2、MDA含量的影响

实验结果如表3所示,与空白对照组小鼠相比,各组小鼠肝组织中H2O2、MDA含量均有所下降(P<0.05或P<0.01);并且给3.9 mg/kg番茄红素纳米分散体样品的小鼠肝组织中T-AOC活性升高(P<0.05),SOD活性明显升高(P<0.01)。与3.9 mg/kg脂溶组相比,在相同剂量下,给番茄红素纳米分散体样品的小鼠肝组织中SOD活性明显升高(P<0.05)。T-AOC反映机体总抗氧化能力,机体抗氧化能力的强弱与健康程度存在密切联系;SOD是一种重要的抗氧化酶,能清除超氧阴离子自由基保护细胞;过氧化氢是活性氧,可以直接氧化一些酶的巯基,使酶失去活性,并可透过大部分细胞膜进入细胞内,形成脂质过氧化物,导致细胞膜的损伤。由于机体产生的自由基不能被及时清除,化学性质活泼的自由基与游离或结合状态的不饱和脂肪酸作用,不但改变膜的结构和功能,还诱发脂质过氧化反应产物增多[7]。MDA是过氧化脂质的分解产物,如上所述它间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。通过实验结果分析,可以说明番茄红素纳米分散体具有明显的抗氧化作用,且相同剂量下,纳米分散体比脂溶番茄红素更有效增强SOD活性。

表3 移植型肝癌H22小鼠肝组织的抗氧化活性变化Tab.3 Changes of antioxidant activity of the liver of mice transplanted with hepatoma H22

2.5 对肿瘤组织PCNA表达的影响

阴性对照片肿瘤组织中仅见非特异性背景染色。空白对照组PCNA呈强阳性表达,肿瘤细胞核呈深棕褐色。给予1.95、3.9 mg/kg纳米分散体肿瘤组织PCNA表达色浅;给予3.9 mg/kg脂溶番茄红素肿瘤组织PCNA表达多且色深;阳性对照组PCNA表达最少,色最浅。由表4可知,给予1.95、3.9 mg/kg番茄红素纳米分散体及给予3.9 mg/kg脂溶番茄红素小鼠肿瘤组织的PCNA阳性表达细胞数较空白对照组均显著下降,腹腔注射氟尿嘧啶的小鼠肿瘤组织PCNA阳性表达细胞数最低(均P<0.01)。给予不同剂量的番茄红素纳米分散体的小鼠都比给予脂溶番茄红素的小鼠肿瘤组织PCNA阳性表达细胞百分率显著性下降。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白,是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,对DNA复制起着重要作用,其合成和表达与细胞增殖有关,是细胞增殖的标志。本实验结果提示番茄红素纳米分散体可能通过影响荷瘤小鼠肿瘤组织PCNA表达阻止细胞DNA复制而发挥抗肿瘤作用。

表4 肿瘤组织的增殖细胞核抗原阳性表达细胞百分率Tab.1 The percentage of PCNA positive cells in tumor tissue

3 结 语

纳米技术是20世纪80年代末、90年代初迅速发展起来的一项高新科学技术,已广泛应用于材料、化工、医药、通信、能源等领域。近年来纳米技术应用于食品和医药行业,改善了活性成分和药物的水溶性并增加了生物利用度,展示了技术创新的喜人前景[4]。

单线态氧和过氧化物与多种疾病(包括癌症)有关。番茄红素是天然胡萝卜素中最有效的单线态氧捕捉剂[8]。早在20世纪50年代,美国医学专家首次报道番茄红素具有抗癌效应,但番茄红素含多不饱和共轭双键,性质不稳定,易被氧化破坏,不溶于水,这些均影响其生物利用率,因此随后出现的各研究报道不尽一致。因此急需水溶性番茄红素产品的问世。番茄红素水溶性的提高,能使番茄红素更好的应用于饮料、化妆品、复合维生素制品等,发挥其生物活性[9]。本实验通过制备番茄红素纳米分散体,获得粒径纳米级别、水中分散性好、稳定的体系;在此基础上进行体内实验,发现番茄红素纳米分散体比脂溶番茄红素具有更有效的抗肿瘤作用,其机制可能与提高机体的抗氧化活性、抑制肿瘤细胞增殖有关。

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(责任编辑:杨萌)

Antitumor Effect of Lycopene Nanodispersion on Mice Transplanted with Hepatoma

WANG Xiao-lan1, WANG Xuan2, ZHANG Lian-fu2
(1.School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science& Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

To investigate the effect and mechanism of lycopene nanodispersion on tumor growth, lycopene nanodispersion was prepared by the emulsification-evaporation process(the ultrasonic emulsification).The antitumor effect,antioxidant activity and anti-proliferation activity in vivo were studied with the model of mice transplanted with hepatoma H22.The results showed that lycopene nanodispersion was obtained by the process.When mice transplanted with hepatoma H22were treated with 1.95 mg/kg and 3.9 mg/kg lycopene nanodispersion for 10 days,the tumor growth inhibitory rate were 32.37%and 54.34%respectively.The intake of lycopene nanodispersion led to the increase of glutathione peroxidase(GSH-Px)activity,and the reduction of the mice serum malondialdehyde(MDA)content.It also led to the increase of total antioxidant capability(T-AOC)and superoxide dismutase(SOD)activity,but decrease the content of MDA and hydrogen peroxide(H2O2)of liver of mice.It also could inhibit the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in tumor tissue.These results suggestedthat lycopene nanodispersion can significantly suppress the growth of hepatoma H22in vivo.The increases of anti-oxidation activity and anti-proliferation activity may contribute to the antitumor mechanism.

lycopene,nanodispersion,antitumor activity,antioxidant activity,proliferating cell nuclear antigen

TS 202.3

:A

1673-1689(2010)03-0376-05

2009-04-16

国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD27B03);江苏省自然科学基金项目(BK2009517)。

＊通信作者:王晓岚(1962-),女,江苏无锡人,医学博士,副教授,主要从事天然药食研究。Email:wangxl@ jiangnan.edu.cn