刘碧源,曾庆仁,余 平,李艳琴,魏 琦,杨胜辉,刘 彦,张顺科,蔡力汀

2.南华大学公共卫生学院及医学院,衡阳 421001

不同免疫途径对Sj童虫细胞型免疫原诱生的保护性效果及抗体应答差异*

刘碧源1,2,曾庆仁1,余 平1,李艳琴1,魏 琦1,杨胜辉1,刘 彦1,2,张顺科1,蔡力汀1

目的比较研究小鼠经不同途径接种日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)童虫原代细胞(primary juvenile worm cells,pJCs)后所诱导的免疫保护效果,寻找其合适的免疫途径。方法将pJCs经皮下或静脉注射途径免疫昆明小鼠,间隔2w共免疫3次,末次免疫后第4w,与对照组同时经腹部皮肤感染尾蚴30±2尾/鼠,比较三组小鼠的肝脏虫卵数及虫卵肉芽肿的大小、成虫数、虫体大小。同时在第2、3次免疫前及攻击感染前1d,小鼠尾静脉采血,用ELISA法检测抗pJCs-IgG水平。结果pJCs免疫小鼠后,与PBS对照组比,静脉免疫组的减虫率为48.53%、肝卵减少率为54.54%、虫体平均重量减少率为29.62%(P＜0.01)、虫卵肉芽肿面积减少率为36.8%,而皮下免疫组分别为41.28%、43.19%、23.08%、31.2%。IgG抗体水平也是静脉注射组高(PBS组,P＜0.01;皮下注射组,P＜0.05)。结论日本血吸虫童虫细胞免疫原通过皮下和静脉注射均可诱导小鼠产生对日本血吸虫的免疫保护力,其中静脉注射诱导的免疫保护效应最强,提示通过静脉注射日本血吸虫童虫细胞是可行有效的免疫途径。

日本血吸虫;童虫原代细胞;免疫应答;免疫保护

2.南华大学公共卫生学院及医学院,衡阳 421001

血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病。虽然采取综合的吡喹酮化疗和灭螺等治理措施,但是目前仍有几百万人群和各种家畜受到感染。因此,血吸虫疫苗的研究与开发仍然是血吸虫病防治的重点之一。迄今为止,WHO推荐的6种最具有希望的血吸虫疫苗候选分子免疫动物后,均不能稳定地获得40%以上的保护力。我们课题组一直致力于日本血吸虫细胞培养,取得了重要的研究成果〔1-2〕。在此基础上观察了日本血吸虫童虫细胞免疫小鼠后能诱导产生显著的免疫保护性效果。同时对该免疫原的免疫部位、免疫次数和免疫剂量进行了优化〔3-5〕。本研究中,我们选择前期免疫保护作用显著的12d日本血吸虫童虫细胞作为免疫原,通过静脉注射和皮下注射两种不同的途径进行免疫接种,比较它们在特异性的体液免疫应答和免疫保护中的作用,为全面评价日本血吸虫童虫细胞型疫苗的免疫效果提供理论依据,也为疫苗的改进和研发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 寄生虫和实验动物日本血吸虫(中国大陆株)阳性钉螺由湖南省血吸虫病防治所提供。健康6～8w龄雌性昆明小鼠、新西兰兔均购自中南大学动物学部。

1.2 免疫原的制备免疫原的制备参照文献〔3〕:用门静脉灌注法从日本血吸虫尾蚴感染兔收集第12d的童虫,用含抗生素(1 000IU/mL青霉素G和1 000μ g/mL链霉素)无菌 PBS反复洗涤后,将虫体在300目网筛上轻轻研磨,加入少许PBS后过滤掉虫体碎片。含细胞滤液用于免疫原的制备:收集沉淀细胞用PBS离心洗涤3次,然后用PBS调整细胞浓度为2×107个/mL为原代童虫细胞(primary juvenile worm cells,pJCs),直接用于第1次免疫或经液氮冻存后复苏、洗涤,用于第2、3次免疫。免疫前,所有细胞用PBS调整浓度为2×107个/mL。

1.3 免疫方案及攻击感染30只昆明小鼠随机分为pJCs双侧腹股沟皮下多点注射组、pJCs尾静脉注射组、PBS皮下注射组。pJCs免疫原为12d的血吸虫童虫细胞,调整细胞量约为2×107个/mL,接种量为100μ L/鼠/次 ,对照组注射 PBS 100μ L/次/鼠,各组小鼠平行在0、14和28d分别进行1次免疫。第2、3次免疫前及攻击感染前1d,均作小鼠尾静脉采血,用ELISA法检测抗pJCs-IgG水平。末次免疫后第4w经腹部皮肤感染尾蚴30±2尾/鼠。

1.4 保护性效果的测定感染后第42d,乙醚麻醉、眼眶放血后剖杀小鼠,用肝门静脉灌注法冲虫,分组收集虫体,计算减虫率;将收集的各组虫体称重,观察虫体发育情况。灌注后取鼠肝,部分用于病理组织切片测量肝虫卵肉芽肿大小,部分用于肝虫卵计数。虫卵计数方法,每鼠取1g肝组织匀浆,置于5mL 4%KOH中,37℃摇匀消化过夜,取 200μ L肝组织消化混悬液涂片镜下计算虫卵,得出每克肝卵数(liver eggs per gram,LEPG)。减虫率、LEPG减少率均按下列公式计算:LEPG减少率(减虫率)=[(对照组的平均数-实验组的平均数)/对照组的平均数]×100%。组织病理学观察,每鼠取肝中叶按常规固定,石蜡包埋、切片后作苏木素-伊红(HE)染色,用Motic Images Advanced 3.2病理图象分析系统测量所有单个含毛蚴的虫卵的肉芽肿面积,取各组平均值进行比较分析。

1.5 ELISA检测特异性IgG抗体水平 于第2、3次免疫前及攻击感染前1d收集各试验组小鼠的血清,用ELISA法检测特异性抗血吸虫童虫细胞IgG抗体。先将12d血吸虫童虫反复冻融、超声粉碎,离心取上清为可溶性童虫细胞抗原(soluble juvenile worm antigen,SJWA)。SJWA 用pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释,按1μ g/孔浓度包被96孔板,4℃过夜,封闭、洗涤,用1∶100稀释的各实验组小鼠血清37℃孵育2h。所有样本均设复孔,同时用日本血吸虫感染鼠血清和未感染鼠血清作为阳性对照和阴性对照。PBST洗涤,加入 1∶4 000的H RP-羊抗鼠 IgG,加TMB底物室温显色15min,用5%H2SO4终止,置酶标仪450nm波长测OD值。

1.6 统计学分析 所有数据均表示为均数±标准差(±s)。采用SPSS统计软件进行Student'st检验,P＜0.05为显著性差异。

2 结 果

2.1 减虫率、肝卵减少率 pJCs分别通过腹股沟皮下注射和尾静脉注射的方法免疫小鼠后的减虫率、减卵率见表1。从表1中可知,与PBS对照组比,皮下注射组的减虫率为41.28%、减卵率为43.19%(P＜0.05),静脉注射组的减虫率和减卵率分别为48.53%和54.54%(P＜0.01)。静脉注射组与皮下注射组比,两者差异有显著性(P＜0.05)。

2.2 虫体平均重量减少率 从表2可知,与PBS对照组比,皮下注射组的虫体重量平均减少率为23.08%、静脉注射组的为26.92%,差异有显著性(P＜0.01)。静脉注射组与皮下注射组相比差异有显著性(P＜0.05)。

2.3 肝脏虫卵肉芽肿面积减少率 用Motic Images Advanced 3.2病理图象分析系统对pJCs不同接种途径免疫鼠肝组织内虫卵肉芽肿大小进行测量,结果见表3。各免疫组与PBS对照组比,肝卵肉芽肿面积显著减少(P＜0.05),但静脉注射组和皮下注射组二者间的差异无显著性(P＞0.05)。

表1 各组的虫荷数和每克肝卵数Table 1 Wormburden and LEPG level induced by different immunization routes

表2 各组虫体的发育情况Table 2 Worm average weights induced by different immunization routes

表3 各免疫组鼠肝卵肉芽肿的面积减少率Table 3 Mean areas of granulomas on liver slides from mice induced by different immunization routes

2.4 抗体水平 图1可知,免疫后第2w各免疫组IgG抗体开始逐渐上升,到攻击感染前达最高水平,均明显高于PBS对照组(P＜0.01);静脉注射组诱导的抗体水平也明显高于皮下注射组(P＜0.05)。

图1 各免疫组及对照组小鼠抗pJCs-IgG动态水平Fig.1 Kinetics of total anti-pJCIgG in pJCs immunized mice by different routes

3 讨 论

抗原诱导机体产生免疫应答及免疫应答类型受许多因素的影响,如免疫途径、抗原缓释以及抗原的物理状态等〔6〕。我们在前期研究中已经优化了童虫细胞抗原的免疫剂量和免疫次数〔4-5〕。为获得更理想的保护性效果,本研究进一步优化免疫途径,以选择能诱导高保护性的适宜免疫途径。选用前期研究中免疫效果明显的12d日本血吸虫童虫细胞通过尾静脉注射和腹股沟多点皮下注射两条途径分别免疫小鼠,结果发现,与 PBS对照组(感染对照)比,两次实验经静脉注射免疫鼠的平均减虫率、肝卵减少率和虫体平均重量减少率分别为48.53%、54.54%和26.92%(P＜0.01),该抗攻击感染效果与平行试验的皮下注射组所获结果比,其差异有显著性(P＜0.05)。在抗体应答方面,IgG抗体水平也是静脉注射组高(与PBS比,P＜0.01;与皮下注射组比,P＜0.05)。该结果表明,用12d童虫细胞通过静脉注射和皮下注射的方法免疫小鼠均可获得显著的保护性效果和较高的抗体水平,尤其是静脉注射组的效果明显优于皮下注射组。值得注意的是,我课题组之前报道的皮下免疫效果均高于本次,其原因既可能与细胞制备批间差异(如细胞活力)有关,也可能与不同批动物差异有关〔3-5〕。有关免疫途径对疫苗免疫效果的影响,研究报道并不完全一致,有的甚至互为矛盾。这可能是不同接种途径所涉及的抗原提呈不同,免疫效果不同,因而可产生不同类型、不同强度的免疫应答。Porgador and Gilboa〔7〕报道抗原肽刺激的DC疫苗能诱导小鼠产生对肿瘤的保护性免疫。Eggert等〔8〕研究DC疫苗经皮下、腹腔和静脉输注后在小鼠体内的分布,结果显示:静脉注射后DC迅速分布到肺组织,48h后以脾脏分布最多;而皮下和腹腔注射后DC在肺、肝和脾脏的分布明显要低。Power〔9〕的研究结果也表明静脉注射免疫途径效果要好。这可能是由于静脉注射的抗原容易更快地到达二级淋巴器官,迅速与免疫细胞接触而发挥更好的保护性作用。这些研究报道与我们的研究结果一致,表明通过静脉注射免疫小鼠也是日本血吸虫童虫细胞型疫苗一条可行有效的免疫途径。

〔1〕龚燕飞,曾庆仁,张祖萍,等.日本血吸虫童虫细胞体外培养条件的初步研究〔J〕.中国人兽共患病杂志,2005,21(2):159-163,124.

〔2〕刘伟,曾铁兵,曾庆仁,等.日本血吸虫成虫体外传代培养细胞的生物学鉴定〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2006,24(5):395-397.

〔3〕曾庆仁,林雪迟,龚燕飞,等.一种新型日本血吸虫疫苗(童虫活细胞)诱导小鼠产生有效保护性免疫力的研究〔J〕.中国现代医学杂志,2004,14(14):84-97.

〔4〕Zeng T B,Cai L T,Zeng Q R,et al.Immunization of mice with cells from juvenile worms ofSchistosoma japonicumprovides immunoprotection against schistosomiasis〔J〕.Science in China Series C:Life Sciences,2007,50(6):1-9.

〔5〕Cai L,Zeng T,Zeng Q,et al.Schistosoma japonicum:protective immunity induced by schistosomulum-derived cells in a mouse model〔J〕 .J Parasitol,2008,94(2):395-403.

〔6〕金伯泉.医学免疫学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2008:32.

〔7〕 Porgador A,Gilboa E.Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocy tes〔J〕.J Exp Med,1995,182(1):255-260.

〔8〕Eggert AA,Schreurs M W,Boerman OC,et al.Biodistribution and vaccine efficiency of murine dendritic cells are dependent on the route of administration〔J〕.Cancer Res,1999,59(1):3340-3345.

〔9〕Power CA,Wei G,Bretscher PA.Mycobacterial dose defines the Th1/Th2 nature of the immune response independently of whether immunization is administered by the intravenous,subcutaneous,or intradermal route〔 J〕.Infection and Immunity,1998,66(12):5743-5750.

Comparison of the immune protective effect and antibody response of primary cells fromschistosomulumby two different immunization routes in mice

LIU Bi-yuan1,2,ZENG Qing-ren1,YU Ping1,LI Yan-qin1,WEI Qi1,YANG Sheng-hui1,LIU Yan1,2,ZHANG Shun-ke1,CAI Li-ting1

(1.Cell&Molecular Biological Experiment Center and Department of Immunology and Parasitology,Xiangya Medical School,the Central South University,Changsha410013,China;
2.School of Public Health and Medicine,University of South China,Hengyang421001,China)

In order to observe the influence of immunization route on the immune protective effects induced by primary juvenile worm cells(pJCs),Kunming mice were inoculated intravenously or subcutaneously with pJCs from 12 day-oldSchistosoma japonicumrespectively.All mice were immunized three times at 2 weeks interval and were challenged each with 30±2 cercariae by abdominal skin penetration 4 weeks after the last booster.Six weeks of post-infection,mice were sacrificed by aether inhalation,and the numbers of worms and hepatic eggs were counted.Specific anti-pJCs levels in the mice sera collected one day before the second,third immunization and challenge infection were tested with ELISA.Mice immunized with pJCs given i.v.or s.c.exhibited high level of specific antibody and protection effects,but given i.v.was significantly higher than given s.c.in anti-pJCs level(P＜0.05)and showed significant reduction in worm burden(48.53%),liver eggs per gram(LEPG)load(54.54%),worm average weight(29.62%)and egg granuloma size(36.8%).The juvenile worm cells ofS.japonicumcould induce partial protective immunity againstS.japonicumin mice and the protective immunity by i.v.was better than that by s.c..These results indicated intravenous route was a feasible and efficacious route for juvenile worm cell immunization.

Schistosoma japonicum;primary juvenile worm cell;immune response;immunoprotection

R383.2

A

1002-2694(2010)07-0615-03

*国家自然科学基金(30570952)资助

余平,Email:yuping1953@sina.com

1.中南大学湘雅医学院免疫学系及细胞与分子生物学实验中心,长沙 410013;

2009-12-20;

2010-03-29