代雪茹,马晟利,吕秋菊,孙 剑

(1.黑龙江省佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154001;2.黑龙江省医院 黑龙江 哈尔滨 150001;)

血链球菌对牙周炎主要致病菌拮抗作用机理研究

代雪茹1,马晟利2*,吕秋菊1,孙 剑1

(1.黑龙江省佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154001;2.黑龙江省医院 黑龙江 哈尔滨 150001;)

*通讯作者

血链球菌是牙周优势细菌,被认为是拮抗牙周可疑治病菌的主要有益菌[1,2]。在龈下菌斑的形成中有重要作用。血链球菌作为有益菌群成员之一,它对大多数牙周可疑致病菌,如牙龈卟啉单胞菌、伴放线杆菌等都具有抑制作用[1]。本实验通过对wistar大鼠剥离牙龈及龈沟内接种牙龈卟啉单胞菌诱发牙周炎,将血链球菌培养的活菌体对牙龈卟啉单胞菌进行拮抗,并观察其对牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性wistar大鼠45只,体重在220 g-260 g左右,购自佳木斯大学动物实验室中心。

1.2 标准菌株

血链球菌ATCC 10556(由华西医科大学卫生部口腔微生态重点实验室提供);牙龈卟啉单胞菌ATCC 33 277(由首都医科大学口腔基础实验室提供)。

1.3 wistar大鼠牙周炎模型建立

1.3.1 大鼠适应性喂养7天后,随机分为2组。正常对照组15只,正常喂养,不作特殊处理;牙周炎组30只:在喂养中用10%的高糖水替代饮水,动物适应性喂养7天后,于第8天开始隔日给予大鼠左侧上颌第一磨牙龈沟内接种牙龈卟啉单胞菌及牙龈剥离,直到建立模型成功。

1.3.2 结果判断 通过临床观察、组织病理及牙龈卟啉单胞菌的检测各项指标均能证明牙周炎模型的建立。

1.4 应用血链球菌培养活菌体对大鼠左侧上颌第一磨牙的牙龈卟啉单胞菌进行干预

1.4.1 实验分组 将经检测的Wistar大鼠随机分为2组,并设立空白对照组。

1.4.2 空白对照组 对建模时对照组中的Wistar大鼠左侧上颌第一磨牙的牙龈卟啉单胞菌进行检测,结果阴性者中随机选取10只。饮食、饮水均正常。不加任何干预。每4天检测一次,共检测7次,其观察牙龈卟啉单胞菌在大鼠口腔中的情况。

1.4.3 活菌体、PBS缓冲液组 对成功建模后的Wistar大鼠左侧上颌第一磨牙的牙龈卟啉单胞菌进行检测,结果阴性者中随机选取20只共分2组,各组10只,饮食、饮水均正常。从经检测后开始,两组每日分别给大鼠左侧上颌第一磨牙牙颈部涂抹活菌体,PBS缓冲液。连续涂抹28天,每4天检测一次,共检测7次,其观察牙龈卟啉单胞菌在大鼠口腔中的情况。

1.4.4 观察指标 临床观察:观察各组大鼠牙龈炎症情况和X线片牙槽骨吸收及牙周情况。组织病理:各组分别在8周后处死大鼠,分离其上颌骨并截取磨牙段,10%甲醛固定48 h,脱钙,切片和HE染色,观察各组大鼠牙周组织病理变化。

2 结果

2.1 临床观察结果 对照组未发现牙龈红肿及探针出血情况,X线片示牙槽骨十分致密,未见牙槽骨吸收;牙周炎组牙龈明显红肿,探针易出血,X线片显示可见左侧上颌第一磨牙垂直吸收,明显可见牙槽骨吸收及根分歧处病变;PBS缓冲液组牙龈红肿,探针易出血,X线明显可见牙槽骨吸收及根分歧处病变情况;活菌体组牙龈红肿及探针出血不明显,左侧上颌第一磨牙可见远中牙槽骨吸收,根分歧处有不同程度的病变。

2.2 组织学观察结果 对照组大鼠牙周组织结构正常,龈沟上皮、结合上皮完整无钉突,牙周膜纤维排列整齐,牙槽骨中未见破骨细胞;牙周炎组牙龈上皮增生,少量急性炎症细胞及大量慢性炎症细胞浸润,牙周主纤维束断裂,牙槽骨明显吸收,结合上皮有钉突形成,牙周袋内有较多慢性炎症细胞;PBS缓冲液组结合上皮中有大量炎性细胞浸润,有深牙周袋形成,牙槽骨中可见破骨细胞,牙槽嵴及临近牙周膜的牙槽骨吸收较明显;活菌体组结合上皮中出现炎性细胞,牙周袋形成,牙槽嵴顶吸收,可见少量破骨细胞。

2.3 牙龈卟啉单胞菌的菌落数变化

2.3.1 建立牙周炎模型成功后对2组大鼠左侧上颌第一磨牙牙颈部分别涂抹活菌体、PBS缓冲液连续28天,均4天检测一次的整个观察期内牙龈卟啉单胞菌菌落数变化情况,见表1。

表1 两种培养方法不同时间点菌落数比较(cfu/ml)(±s)*

表1 两种培养方法不同时间点菌落数比较(cfu/ml)(±s)*

*多变量分析结果表明四组菌落数有统计学差异,P＜0.05

组别时间(天)未涂菌 4 8 12 16 20 24 28 PBS 133.4±5.5 129.7±5.6 126.4±5.5 122.9±5.0 117.8±3.9 111.7±3.9 105.1±3.8 98.1±3.0活菌 137.9±7.7 132.2±6.5 120.9±6.1 110.5±4.4 98.6±6.2 86.9±4.6 73.6±5.1 55.2±5.9

2.3.2 将活菌体组与PBS培养组菌落数进行比较,可见在各个时间点活菌体组菌落数均少于PBS培养组的菌落数,随着时间的推移可见明显的差异。证明血链球菌的活菌体对牙龈卟啉单胞菌有拮抗作用。

3 讨论

牙周病是一种细菌感染性疾病,大量的研究表明口腔微生态系不仅包括一些可疑的致病菌还包括许多牙周有益菌,有益菌与致病菌之间存在相互拮抗的生态关系,从而有利于保持或恢复牙周的健康状态。血链球菌是口腔生态系的重要生理菌和牙周有益菌之一,在维持牙周生态平衡与健康中起重要作用。血链球菌对牙周可疑致病菌的拮抗作用在体外实验和动物模型研究中得到初步证明。许多学者认为血链球菌能通过其分泌的过氧化氢及血链素拮抗牙周可疑致病菌[3,4]。此前众多学者在进行血链球菌拮抗作用的体外研究主要应用Sabine法[5]进行。其结果表明血链球菌对牙龈卟啉单胞菌、中间普沃菌和具核梭杆菌的生长均有拮抗作用,其中对牙龈卟啉单胞菌的作用较强。

对血链球菌的深入研究是牙周病生态防治工作的重要内容,为探讨血链球菌与牙周可疑致病菌的相互作用及进一步明确血链球菌拮抗牙周可疑致病菌的机理,本实验将血链球菌培养的活菌体对牙龈卟啉单胞菌进行拮抗,并其观察了血链球菌培养活菌体是否可以阻止或减少牙周可疑致病菌牙龈卟啉单胞菌的生长。研究结果表明血链球菌培养的活菌体对牙龈卟啉单胞菌的生长有拮抗作用,提示血链球菌产生的抑菌物质主要存在于菌细胞内,且活的菌细胞通过新陈代谢不断地产生这类抑菌物质作用于周围环境中其他细胞。关于血链球菌培养的活菌体能否在临床上发挥作用以及能否将血链球菌的活菌体作为一种抗牙周病因子应用于牙周病的防治有待进一步研究。

[1]Hillman J D,Sm,ransky S S,ShiversM The relationships between streptococcal species and periodontopathic bacteria in human dental plaque[J].Arch Qral Biol,1985,30(11-1 2):791.

[2]Fiehn N E,Klausen B,Evans R t.Periodontal bine loss in Porphyromonus gingivalis-infected specific pathogen-free rars dfter preinoculation with endogenous Streptococcus sanguis[J].J Periodontal Res,1992,27(6):609.

[3]Socransky S S,Haffajec A D.Microbiol mechanisms in the pathogenesis of destryctive periodontal diseases:a critical assessment[J].J Periodontal Res,1991,26(3pt2):195.

[4]Lehree R I,RosemanM,Harwig S S,et al.Ultrasensitive assaysfor endogenous antimicrobial polypeptides[J].J Immun M,1991,137(2):167-173.

[5]Sabine D B.An antibiotic.1ike effect of lactobacillus acidophilus[J].Nature(London),1963,199:811.

1007-4287(2010)01-0126-02

黑龙江省自然科学基金项目(D2007-03)

2009-05-16)