宋泽庆,陈 敏,陈莉延

(广东医学院呼吸疾病研究所,广东湛江 524001)

广东籍汉族患者CD14基因-159C/T位点多态性分析

宋泽庆,陈 敏,陈莉延

(广东医学院呼吸疾病研究所,广东湛江 524001)

目的探讨广东籍汉族人CD14基因-159C/T位点多态性和哮喘易感性及对血浆IgE水平的影响。方法正常组和哮喘组各100例。取外周血离心后,用ELISA法测定血浆IgE水平,抽提DNA,用RFLP-PCR方法检测CD14基因-159C/T位点多态性分布。结果对照组和哮喘组等位基因C、T分布差异有显著性(χ2=7.61,P＜0.01),C等位基因和哮喘相关(OR(C/T)=1.77,95%CI=1.178-2.643,P＜0.01)两组基因型(TT、CT、CC)频率的分布差异亦有显著意义(χ 2=7.651,P＜0.01),同组内,C等位基因携带者血浆IgE水平高于非携带者;同一基因型,哮喘组IgE水平高于对照组。结论CD14基因启动子-159位点多态性和哮喘易感性有关,C等位基因和血浆IgE水平升高相关联。

哮喘;CD14;多态性;IgE

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0056)

哮喘是一种变应性疾病,是由环境和遗传因素共同作用引起。遗传易感性在哮喘的发病中起重要作用,对哮喘进行遗传学研究是探讨其发病机制的一个重要方面。本研究通过对哮喘组和对照组CD14基因-159位点多态性及血浆总IgE水平的检测,探讨CD14基因-159位点多态性在哮喘发病中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象

哮喘组:随机选择广东医学院附属医院门诊和住院支气管哮喘患者100例,全部病例均符合中华医学会呼吸分会2003年制定的《支气管哮喘防治指南》标准[1]。年龄 14-71岁,男 55例,女 45例;对照组:随机选择广东医学院附属医院门诊、保健科健康体检人员100人,男53,女47例,年龄17-68岁。经检验,两组人群年龄、性别无显著性差异。上述全部研究对象均为无血缘关系的广东籍汉族人。对照组均无哮喘病史,无家庭及个人过敏史。

1.2 标本收集及基因组DNA抽提 抽取空腹外周血2 ml,EDTA抗凝,离心后留取血浆约100 μ l,-70℃冻存。余下部分用低渗溶解红细胞快速抽提法[2](稍作改良)从白细胞中抽提基因组DNA。

1.3 聚合酶链反应 引物序列参考文献[3]:所需引物5-GTGCCAACAGATGAGG TTCAC-3,5-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3。PCR反应在 PCR仪上进行,总反应体积为50 μ l,80 ng基因组DNA,10mmol/L Tris-HCl(pH8.3),50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,200 μ mol/L dNTP,上下游引物各50 ng,1.5 U Taq DNA聚合酶。反应过程:96℃起始变性3分钟,96℃40秒,56℃40秒,72℃50秒,最后72℃延伸2分钟,共38个循环。

1.4 限制性片段长度多态性检测 取PCR产物10 μ l加AvaⅡ6 U,37℃酶切过夜,然后在2%琼脂糖凝胶,取6 μ l酶切产物在凝胶上上样电泳,EB染色后紫外灯照射下观察成像。-159位点的扩增片段长度为497 bp,基因型TT存在AvaⅡ酶切位点,酶切产物为144 bp、353 bp,TT基因型无此酶切位点。而CT基因型酶切产物则为497 bp、144 bp及353 bp。

1.5 酶联免疫吸附(ELISA) 用ELISA方法检测血浆IgE,严格按说明书操作。

1.6 统计学分析 用基因计数方法计算多态性位点基因型、等位基因频率,其比较及基因型Hardy-Weinburg平衡吻合度用χ2检验;用单因素方差分析(One-way ANOVY)比较正常组和哮喘组血浆IgE水平的差别;不同基因型血浆IgE水平的两两比较用q检验;同基因型不同组血浆IgE水平的两两比较用t检验。以上统计学分析使用SAS 8.2软件进行。

2 结果

2.1 RFLP-PCR检测结果见图1

2.2 哮喘与对照组-159位点基因型频率分布经Hardy-Weinburg平衡吻合度检验达到遗传平衡(表1)。该位点基因型频率和等位基因频率比较见表2。

图1 -159位点PCR产物酶切后电泳结果

表1 -159位点基因型分布的 Hardy-Weinburg平衡

3 讨论

CD14基因位于5q13.1其表达的产物是CD14分子,它是一种LPS受体[4],和LPS有较高的亲和力。很早人们便发现该基因和变应性及血浆IgE水平相关联。Baldini等首先报道了CD14启动子-159位点的CT多态性和变应性有关,他发现该位点TT纯合子sCD14的水平高于CT杂合子和TT纯合子,而IgE水平确低于后两者[3]。香港进行的一项对中国儿童的调查发现该位点CC纯合子和IgE升高是相关的[5]。在本研究中我们发现,哮喘组和正常组间其基因型的分布差异有显著性 χ2=7.651,P＜0.01。在哮喘组和对照组中其携带的C等位基因是有差异的,前者高于后者,研究证实了C等位基因和哮喘有关,C等位基因携带者哮喘的危险性高于T等位基因携带者OR(C/T)=1.77。

表2 -159位点对照与哮喘组等位基因频率及基因型频率比较

表3 -159位点对照与哮喘组不同基因型血浆IgE水平的比较

哮喘是变应性炎症,IgE升高是其一个特征。本研究发现在哮喘组中各等位基因型的分布符合Hardy-Weinburg平衡。无论是哮喘组和对照组不同基因型之间其血浆IgE水平差异有显著性。CC基因型者其血浆IgE明显高于CT和TT,C等位基因携带者有更高的IgE水平,这和以前的研究相同。研究发现CD14启动子多态性使机体出于一种高变应状态,即机体的遗传素质决定了这一规律,虽然从T等位基因到C等位基因的突变使IgE水平升高,但目前尚无资料表明C等位基因和哮喘发病严重程度相关。Koppelman的研究证实C等位基因直接影响变应性的表达和变应的严重程度,即更高的皮肤试验阳性率和IgE水平[6]。现已发现CD14启动子多态性能下调CD14的表达水平,而研究表明CD14和IgE水平呈负相关[7]。CD14能和细菌细胞壁LPS相结合,导致Th0细胞向Th1细胞分化,这种效应可因CD14在浓度的升高而减弱,但具体机制尚未明了[8]。我们推测启动子该位点T到C的突变很可能改变了启动子的转录效率,使转录增加,CD14浓度升高,Th1/Th2平衡向Th2倾斜,炎症因子IL-13,IL-4,IL-5增多,IgE产生增多,最终导致哮喘易感性的出现。

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Association of CD14 gene-159C/T polymorphism with asthma in the chinese Han population from Guangdong province

SONGZe-qing,CHEN Min,CHEN Li-yan.(Institute of Respiratory Diseases,Guangdong MedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the polymorphism at-159 locus in CD14 gene and asthma and its impact upon plasm IgE level.Methods100 asthma subjects and 100 control subjects were chosen.DNA was isolated from the blood.Polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism(PCR/R FLP)techniques were used to determine-159 locus polymorphism,and plasm IgE level were tested by ELISA.ResultsThe distribution of C andT allelesof-159 are significantly different between the two group,(χ2=7.61,＜0.01),C allele is associated with asthma.(OR(C/T)=1.77,95%CI=1.178-2.643,P＜0.01)The genetype(CC,CT andTT)distributionwasalso significantly different betweentwo groups(χ 2=7.651,P＜0.01);in each group,subjectswith C allele has higherIgE level than subjectswithout C allele,asthma group hashigher IgE level than controlgroupwith same genetype.ConclusionThe-159 polymorphism of CD14 gene may be associatedwith asthma.C allele is associated with higher IgE level.

asthma;CD14;polymorphism;IgE

R562.2+5

A

1007-4287(2010)01-0056-03

2009-03-18)