李金龙,耿 力,韩 刚,贾明库

(吉林大学第二医院普通外科,吉林长春 130041)

CpG ODN诱导人PBMC增殖的体外实验研究

李金龙,耿 力,韩 刚,贾明库*

(吉林大学第二医院普通外科,吉林长春 130041)

目的研究CpG ODN在体外刺激人PBMC的增殖情况。方法分别以肿瘤抗原(Ag)、白细胞介素-2(IL-2)和CpG ODN单独或联合刺激正常人和肿瘤患者PBMC,并对其增殖活性进行测定。结果以CpG ODN刺激人PBMC组的细胞增殖活性明显高于对照组(P＜0.05)。结论CpG ODN、IL-2与肿瘤抗原共同刺激能有效提高人PBMC的增殖活性。

CpG ODN;人外周血单核细胞

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0037)

近年来肿瘤的生物治疗研究较多,并取得了一定的疗效与进步。CpG ODN具有激活宿主免疫系统的能力,可刺激机体活化对肿瘤的先天免疫并增强抗原递呈细胞介导的获得性免疫,在疫苗佐剂的设计以及抗肿瘤免疫治疗中显示出良好的应用前景[1]。本文通过观察CpG ODN与IL-2、肿瘤冻融抗原共同刺激人PBMC在体外的增殖情况,为进一步进行相关肿瘤免疫治疗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例选择 分别选取本院健康志愿者和结肠癌患者各5人进行采血20 ml,并在2 h内分离。

1.1.2 肿瘤细胞株、CpG2006和IL-2 人结肠癌细胞株SW1116购自吉林省肿瘤研究所;CpG 2006由上海生工生物技术服务公司合成;IL-2购自长生基因药业股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人PBMC的分离 每份血样中加入等量生理盐水混匀稀释,离心。分离出离心分层后单个核细胞层,另加RPMI1640后离心,洗涤2次。计算活细胞百分数＞95%。

1.2.2 肿瘤抗原的制备 SW111细胞培养、传代。细胞呈指数期生长时,调细胞浓度1×107/ml,共计8.8 ml。放入液氮中10 min,室温融化,反复5次。4℃离心,收上清。同时将细胞沉淀溶于8.8 ml生理盐水中,超声细胞破碎仪破碎、离心,收上清。两次离心收获的上清混合,-80℃保存备用。

1.2.3 PBMC的增殖培养 抗原3倍稀释使之浓度与外周血细胞数之比为1∶10,将CpG ODN与IL-2浓度分别调至100 μ g/ml和 1 000 U/ml。

1.2.4 实验分组 (1)PBMC;(2)PBMC+Ag+IL-2;(3)PBMC+Ag+IL-2+CpG-ODN。

1.2.5 调PBMC细胞浓度为6×106/ml,接种于96孔板,每孔 50 μ l,每组 4复孔。其中PHA 10倍稀释,每孔加 20 μ l。抗原、CpG-ODN 和 IL-2 均每孔加20 μ l。各组分别补加相应体积的IMDM 培养液至200 μ l/孔 。37℃、5%CO2培养72 h,收上清 ,-20℃保存备用。

1.2.6 实验结果测定分两组进行,分别测定CpGODN刺激PBMC3天、6天后PBMC增殖情况。在培养结束前4小时加入MTT(5 mg/ml)20 μ l/孔。培养结束离心,弃上清,各孔加入 150 μ l DMSO混匀,酶标仪492 nm波长测A值。

1.3 统计学处理

采用SPSS11.0软件做方差分析和t检验。

2 结果

无论是在正常人组还是在肿瘤组,CpG组PBMC细胞增殖活性均明显高于对照组(P＜0.05)。而肿瘤组与正常人组相比较,其PBMC增殖活性则无显著性差异(表1、2)。

表1 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性测定(正常人组,±s,n=4)

表1 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性测定(正常人组,±s,n=4)

与PBMC空白对照组相比,*P＜0.05;与不加CpG的相应对照组相比,△P＜0.05

组别A 值(±s)培养3天 培养6天PBMC 0.231±0.006 0.383±0.066 PBMC+Ag+IL-2 0.298±0.003* 0.457±0.031 PBMC+CpG+Ag+IL-2 0.423±0.006*△ 0.691±0.005*△

3 讨论

过继免疫治疗是近年来肿瘤治疗的新方法之一,其基本原理是通过输注自体或同种异体特异性或非特异性肿瘤杀伤细胞(主要为免疫活性细胞)而达到治疗肿瘤的目的。1985年美国学者Rosenberg等创立IL-2+LAK细胞疗法后,这种疗法得到广泛的重视,现已形成了先在体外激活和扩增杀伤肿瘤细胞的效应细胞,然后再回输病人的这种程序[2]。肿瘤特异性CTL细胞取自患者自身的外周血淋巴细胞,在有肿瘤抗原及IL-2存在的条件下,在体外进行二次致敏和扩增。这种细胞特异性高,杀伤力强。但由于治疗肿瘤时要求效应细胞与靶细胞比例保持在100-10/1,治疗一次需要细胞较多,应用上受到一定的限制。

表2 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性测定(肿瘤组,±s,n=4)

与PBMC空白对照组相比,*P＜0.05;与不加CpG的相应对照组相比,△P＜0.05

本实验中应用的CpG2006为B型CpGODN,是由三磷酸核苷酸和多个未甲基化的CpG二核苷酸共同构成PTO骨架,并由PolyT间隔4个TCGT基序组成的24 bp的寡核苷酸片断,为全硫代硫酸二酯键修饰,具有抵抗细胞内核酶降解作用的全程留待修饰的PS骨架(核苷酸的磷酸二酯键的游离氧原子被硫代修饰),这种骨架有力于加强对淋巴细胞的刺激作用。本研究发现应用全硫代的CpG 2006与IL-2、肿瘤冻融抗原共同刺激能有效的提高正常人和肿瘤病人的PBMC的增殖活性。实验结果也证实CpG2006能有效地促进外周血单个核细胞的增殖,国外文献亦有相同报导[3]。

[1]WeinerGJ,Liu H M,Wooldridge JE,et al.Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:10833.

[2]Rosenberg SA,Lotze MT,Yang JC,et al.Experience with the use of highdose interleukin-2 in the treatment of 652 cancer patients[J].Ann Surg,1989,210:474.

[3]Gursel M,Verthelyi D,Klinman DM.CpG oligodeoxynucleotides induce human monocytes to mature into functional dendritic cells[J].Eur J Immunol,2002,32:2617.

The proliferation of human PBMC induced by CpG ODN in vitro

LI Jin-long,GENGLi,HAN Gang,et al.(The Second Hospital of Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectiveStudy the proliferation of human PBMC stimulated by CpG ODN in vitro.MethodsStimulate PBMCs of health adults and patientssuffered from cancer with tumor antigen,IL-2 or CpG ODN and determine their proliferative activity.ResultsThe cell proliferation activity of CpG ODN stimulating group is higher than the other groups(P＜0.05).ConclusionThe proliferative activity of human PBMC can be improved effectively with the stimulations of CpG ODN,IL-2 and tumor antigen together.

CpG ODN;PBMC;Proliferation

R730.54

A

1007-4287(2010)01-0037-02

吉林省科技厅资助项目(项目编号20050410-5)

*通讯作者

2008-12-24)