刘 川,毕 峰,杨明妍,罗 速

(1.北华大学附属医院神经一科,吉林吉林市 132013;2.北华大学医学院;3.吉林省脑科医院;4.北华大学)

RNA干扰Survivin基因在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的作用

刘 川1,毕 峰2,杨明妍3,罗 速4*

(1.北华大学附属医院神经一科,吉林吉林市 132013;2.北华大学医学院;3.吉林省脑科医院;4.北华大学)

目的 利用RNAi技术沉默人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞Survivin基因。方法应用RNAi技术,以pGCsi/U6质粒为载体构建Survivin-siRNA重组质粒,体外转染SH-SY5Y细胞,通过RT-PCR检测Survivin基因的表达。结果重组质粒转染SH-SY5Y细胞后其生长明显受抑制;Survivin基因的表达明显低于对照组(P＜0.01),达到了抑制效果。结论RNAi可明显降低人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中Survivin基因的表达,从而抑制细胞生长,促进凋亡。

RNA干扰(RNAi);Survivin;神经母细胞瘤

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1179)

神经母细胞瘤是最常见的周周神经系统恶性肿瘤[1],可发生于肾上腺及交感神经部位,极易发生转移。本实验根据Survivin基因的结构设计特异性siRNA,构建Survivin-siRNA载体,将其转入神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中,观察转染后的变化,从而为神经母细胞瘤的基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DNA片段纯化试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司);siRNA引物(上海生工);λ-Hind Ⅲ DNA Marker、DNA Marker DL 2000(TIANGEN);DNA Ligation Kit、RT-PCR Kit、限制性核酸内切酶HindⅢ、限制性核酸内切酶BamHⅠ、DNA Marker DL8000(上海生工);SH-SY5Y细胞(北华大学生命科学中心姜锐老师赠);pGCsi/U6质粒(上海吉凯);倒置显微镜(olympus);电穿孔转染仪(中国上海)。

1.2 pGCsi/U6/Survivin siRNA重组质粒的构建与鉴定

1.2.1 pGCsi/U6/Survivin siRNA重组质粒的设计与合成 根据人Survivin基因cDNA序列(genbank:NM-001168)设计19 bp-29 bp的siRNA,其第一个碱基应为G,GC的数量在40-50%,且不应连续出现3个以上的T。故选取目的基因序列5′-GGACCACCGCATCTCTACA-3′设计DNA双链(SVV-1 siRNA);同时构建阴性质粒序列为5′-TTCGAATCCGTCCGTACGT-3′DNA 双链(SVV-2 siRNA)。pGCsi/U6载体适合于将带有5'BamHⅠ和3'HindⅢ接头的两个互补核苷酸插入,由上海生物工程公司完成合成。

1.2.2 载体的线性化及回收 (1μg/μl)纯化的DNA 质粒 1 μl、ddH2O 15μl、10 ×buffer(10 ×)2 μl、BamH Ⅰ(10U/μl)1μl、Hind Ⅲ(10U/μl)1μl,37℃下双酶切1 h,酶切后片段具有粘附性,再加pH为8.0的0.5mol/L的EDTA,使浓度达10mmol/L终止,1%琼脂糖凝胶电泳30min鉴定并回收产物。

1.2.3 连接、连接产物的转化与筛选 由RNase去离子水、目的DNA片段、T4连接酶、10×T4 DNA Buffer和质粒DNA载体片段构成连接反应体系,混匀,4℃经16 h完成连接。再用JM109大肠杆菌制备感受态细胞,重组质粒转化入感受态细胞,筛选呈乳白色的阳性克隆菌落(阴性多为蓝色)。

1.2.4 重组质粒的提取与鉴定 提取后质粒行10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察结果。测序鉴定。

1.3 pGCsi/U6/Survivin siRNA重组质粒的转染

SH-SY5Y细胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养液,置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。当细胞处于对数生长期时离心,用电穿孔法转染重组质粒DNA。转染实验分三组:(1)空质粒组;(2)阳性重组质粒组(siRNA-SVV-1);(3)阴性重组质粒组(siRNASVV-2)。电穿孔条件:电压540 V,脉宽30μs,脉冲次数3次,脉冲间隔时间1min室温,缓冲液pH7.2,操作完成后,将电转杯静置10min。将细胞转移到6孔培养板中,加入细胞培养液2ml,37℃5%CO2培养。

1.4 重组质粒对细胞生长的抑制

将各质粒分别转染SH-SY5Y细胞,72小时后倒置显微镜下观察细胞的生长状况。细胞长至80%融合时,PBS洗两次,接种到96孔板中,每孔200μl。将各孔加入浓度为5 g/LMTT20μl,温箱孵育4 h。加入150μl的DMSO,微振荡器振荡 10min,酶联检测仪上测波长570 nm的吸光度(A)值。细胞存活率%=(实验组A均值/对照组A均值)×100%。

1.5 Survivin抑制效应的检测

提取转染细胞总RNA,以β-actin为对照,根据Survivin基因序列设计引物,进行逆转录,1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5μg/ml溴化乙锭),室温,电泳30min。

2 结果

2.1 pGCsi/U6质粒的线性化pGCsi/U6经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化,结果见图1。

2.2 重组质粒PCR电泳鉴定10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果见图2。

2.3 重组质粒测序结果挑选1个阳性克隆进行DNA测序,合成的siRNA序列正确,并克隆于pGCsi/U6的BamHⅠ、HindⅢ两个酶切位点之间(217 bp-279 bp),该序列位于U6启动子的下游,重组质粒测序结果见图3。

2.4 重组质粒抑制SH-SY5Y细胞的生长将质粒分别转染96孔板内生长的SH-SY5Y细胞,72小时后倒置显微镜观察转染细胞的生长状况,空质粒组及阴性重组质粒组细胞生长状况良好,大多数细胞贴壁,细胞胞体及突触状态良好;阳性重组质粒组SH-SY5Y细胞大多悬浮,突触消失。MTT法测SHSY5Y细胞24-72 h生长状况,发现阳性重组质粒能明显抑制SH-SY5Y的生长,并呈现时间依赖性,抑制率高达50.4%,表明siRNA-SVV-1可抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长。

2.5 Survivin抑制效应的测定RT-PCR法检测各组细胞SurvivinmRNA,β-actin在各组间表达无明显差异,siRNA-SVV-1组 Survivin/β-actin灰度比0.15,显著低于空白组、空质粒组和 siRNA-SVV-2组的Survivin/β-actin灰度比0.97、0.95和0.88,抑制率为88.72%,与对照组间存在显著差异(P＜0.01),而空白组、空质粒组和siRNA-SVV-2组间无显著差异(P＞0.05)。达到了抑制Survivin基因的效果,结果见图4。

图1 pGCsi/U6质粒经BamHⅠ和H indⅢ酶切线性电泳图

图2 重组质粒PCR鉴定图

图3 重组质粒测序鉴定图

图4 RT-PCR电泳检测结果图

3 讨论

肿瘤的形成的不仅仅是增值过度,其凋亡同样存在异常,Survivin基因是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis,IAP)家族的独特成员,在大多数肿瘤组织及胚胎组织中高表达[2]。目前RNAi已被广泛应用于基因功能以及基因治疗研究[3,4],本实验针对目的基因设计特异性siRNA,外源性基因片段插入到pGCsi/U6质粒的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组载体,基因测序显示重组质粒在序列、方向、长度方面与设计目的一致。经转化后完成重组载体的体外基因克隆,再转染SH-SY5Y细胞,转染48 h后经RT-PCR检测,结果显示重组质粒可导致Survivin基因沉默。RNAi技术作为基因诊断、治疗新的手段具有很高的潜力,对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞的Survivin基因有抑制作用,可能为今后神经母细胞瘤的基因治疗提供新方法、新靶点。

[1]Nakag awara.A Molecular basis of spontaneous regression of neuroblastoma:role of neurotrophic signalsand geneticabnormalities[J].Hum Cell,1998,11:115.

[2]Sarela AI,Macadam RC.Expression of the antiapoptasis gene,survivin,predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J].Gut,2000,46∶645.

[3]Stevenson M.Therapeutic potential of RNA interference[J].N Engl JMed,2004,351(17):1772.

[4]Silva J,Chang K,Hannon GJ,et al.RNA-interference-based functionalgenom ics inmammalian cells:reversegenetics com ing of age[J].Oncogene,2004,23(51):8401.

The Function of RNAiSurvivin Gene on SH-SY5Y Cells in Human Neuroblastoma

LIUChuan,BIFeng,YANGMing-yan,et al.(Department of Neurology,Affiliated Hospital of Beihua University,Jilin132013,China)

ObjectiveTo inhibit Survivin on SH-SY5Y cells of human neurob lastoma by using RNAi technology.MethodsConstructing Survivin-siRNA in vitro transfection SH-SY5Y cells on the basis ofpGCsi/U6 by using RNAi technology,then testing the growth of the cells and theexpression stateof Survivin by themethod of RT-PCR.ResultsThegrow th of recombinant transfected SHSY5Y cells is obviously inhibited;Theexpression of Survivin is obviously lower than the contrastgroup(P＜0.01),achieving the inhibitory effect.ConclusionTheexpression of Survivin in SH-SY5Y cells can reduce in human neurob lastomaby using RNAi technology,thus inhibit the cell grow th and promote apoptosis.

RNAi;Survivin;Neuroblastoma

R739.4

A

1007-4287(2010)08-1179-03

*通讯作者

2009-04-09)