钱 冉,郑 芳,郭书忍,杨 娜

(1.武汉大学中南医院基因诊断中心,湖北武汉 430071;2.咸宁学院实验诊断学教研室)

MLXIPL 、PMVK 、TRIB3基因启动子区甲基化检测方法的建立

钱 冉1,2,郑 芳1*,郭书忍1,杨 娜1

(1.武汉大学中南医院基因诊断中心,湖北武汉 430071;2.咸宁学院实验诊断学教研室)

目的 建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区DNA甲基化检测的方法。方法用亚硫酸氢钠和对苯二酚处理外周血细胞基因组DNA标本,以修饰后的DNA标本为模板,每个基因分别用内外侧两套不同的引物对启动子区进行巢式扩增。PCR产物进一步克隆、测序。结果测序结果表明,MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基则不改变。结论成功地建立了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因甲基化检测的方法,为探索基因启动子区甲基化与疾病的关系做出了铺垫。

甲基化;MLXIPL;PMVK;TRIB3;巢式联合TD-PCR

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1166)

甲基化是真核细胞中DNA正常的修饰方式,但异常的甲基化常成为很多疾病发生的重要因素。目前在许多疾病中已经发现了DNA有不同程度的异常甲基化。已经确定的有动脉粥样硬化(AS)病人中雌激素受体基因启动子区高甲基化是导致AS的一个重要因素[1];恶性肿瘤病人肿瘤细胞基因组范围出现DNA甲基化水平降低,且降低的程度与肿瘤的恶性度相一致。本实验根据 MLXIPL、PMVK、TRIB3基因启动子区CpG岛的分布情况,联合应用巢式、Touchdown PCR对其进行扩增并克隆测序,以明确基因的CpG岛甲基化状态。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象和标本 武汉大学中南医院体检中心正常人群。标本为外周血白细胞基因组DNA。

1.1.2 试剂 外周血基因组DNA提取试剂由自己配置,亚硫酸氢钠和对苯二酚购自Sigma公司;DNA WinzardTMclearn-up system购自Promega公司;DNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司;TaqDNA聚合酶购自铂优生物技术有限公司;PGM-T载体克隆试剂盒和Marker(50 bp ladder)购自北京天根生化科技有限公司;引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的制备 采2ml EDTA-Na2抗凝的静脉血,用改良的NaI法及蛋白酶K法提取基因组DNA。再用QIAGEN公司试纯化剂盒纯化基因组DNA。然后在2%的琼脂糖上电泳,并用紫外分光光度计检测其浓度和纯度,置-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA ①DNA的重亚硫酸盐处理:约2μg DNA用DDW 稀释至50μl,加5.5μl新鲜配制3MNaOH,55℃孵育20min使基因组DNA充分变性。水浴期间配制10 mM对苯二酚(氢醌),亚硫酸氢钠溶液即2.7 g亚硫酸氢钠溶于4m l水并用10mMNaOH调pH值至5.0左右,定容至5 ml。加520μl的亚硫酸氢钠溶液、30μl氢醌于水浴好的溶液中,再加入200μl石蜡油55℃水浴避光不超过16 h。②纯化基因组DNA:使用PromegaWizard Clean up DNA纯化回收系统(Promega,A 7280)按照说明书进行DNA纯化回收。③去硫酸化和沉淀DNA:在纯化好的样本中加入4μl 3MNaOH,37℃放置15 min。再加22μl6M乙酸铵,4μl10 g/L糖原,250μl无水乙醇,置-20℃过夜沉淀④回收前一天过夜沉淀的DNA:4℃12 000 rpm离心15min,弃上清,收集沉淀,加入180μl 70%乙醇,4℃12 000 rpm离心5 min后弃上清并重复一次再加将残存液体吸净,室温干燥10min后加入TE重悬,-20℃保存备用。

1.2.3 PCR ①根据UCSCGenome Browser Home(http://genome.ucsc.edu)中查到的启动子区的序列,并针对3个基因的CG二核苷酸密集区设计引物,引物序列如表1。

表1 MLXIPL、PMVK、TRIB3引物序列和产物长度

②扩增启动子片段:PCR扩增体系25μl,其中无菌去离子水15.5μl,10×反应缓冲液2.5μl,4×dNTP混合物2.5μl(2.5 mmol/L),正反向引物各1 μl(10 pmol),TaqDNA聚合酶 2.5U,DNA模板2μl。3个基因均采用一个扩增条件,如表2。

表2 PCR扩增条件

1.2.4 克隆及测序 将MLXIPL、PMVK、TRIB3的PCR产物和pGM-T载体连接,按照试剂盒说明书操作,将重组质粒转入试剂盒感受态细胞,再接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板上面并挑取单菌落,重组质粒经PCR鉴定后,送北京诺赛基因测序公司测序。

2 结果

2.1 PCR结果

以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基处理后的外周血基因组DNA 为模板,对MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区及第一外显子区进行巢式扩增,先用外侧引物扩增,2%琼脂糖鉴定无目的条带;再直接以外侧产物2μl为模板,用内侧引物25μl体系扩增,得到PCR产物。结果经2%琼脂糖鉴定为目的序列。MLXIPL基因启动子内侧产物目的片段长度248 bp;TRIB3基因启动子内侧产物目的片段长度261 bp;PMVK基因启动子内侧产物目的片段长度246 bp。见图1-3。

2.2 克隆测序结果

3种基因重组质粒测序结果表明,启动子区CpG岛中甲基化的C碱基在亚硫酸氢盐处理后未发生改变。而未甲基化的C碱基经亚硫酸盐处理后变为U碱基,再经PCR后在测序图中表现为T碱基,即CG转变为TG。

图1 基亚硫酸氢钠处理后MLXIPL因启动子区CpG岛的PCR产物

图2 基亚硫酸氢钠处理后PMVK因启动子区CpG岛的PCR产物

图3 亚硫酸氢钠处理后TRIB3基因启动子区CpG岛的PCR产物

3 讨论

甲基化的检测方法有很多,目前关于特异位点DNA甲基化的检测应用得比较多的方法如下:①甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction endonuceasesMS-RE)-PCR/southern法②甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)③结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulphate restriction analysis,COBRA)④甲基化敏感性单链构象分析(methylation-specific single-strand conformation-analysis,MS-SSCA)[2]。这些方法都可以间接的反映某些CpG岛的甲基化状态,有的方法既价廉操作步骤又简单,但是它们无法明确目的片段中每一个CpG位点的具体甲基化状态,仅针对一个或者几个CpG岛。DNA甲基化是一个量变的过程,要研究MLXIPL、PMVK、TRIB3他们的启动子区甲基化与疾病病的关系,靠以上方法提供的信息是远远不够的。我们需要明确其启动子区具体每一个CpG位点的特定甲基化状态。而亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法恰能提供这些信息:标本经过过亚硫酸氢钠处理后可将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,后者经PCR反应扩增克隆变成胸腺嘧啶而产生T:A配对,但对甲基化的胞嘧啶亚硫酸氢钠则没有作用,DNA甲基化状态不同的片段就可转化为有碱基序列差异的2个片段,再通过克隆测序,不仅可以在测序过程中把目的序列全部CpG岛给完整测出,还可以明确目的序列每一CpG岛的甲基化状态,这就为疾病与甲基化关系的研究提供了完整的信息。

在试验过程中,亚硫酸氢钠修饰过的基因组DNA存在着PCR扩增困难的问题。因为基因组DNA在修饰过程中,大部分的DNA己被降解成较小片段,回收后的DNA含有大量非全长目的DNA片段,纯化过程中也伴随DNA模板一定量的丢失[3]。而且因为碱基的变化即C变成U,使得序列的一致性增加导致引物设计困难,在设计过程中导致较多的引物错配、二聚体及发夹结构。我们在引物设计过程中先避开基因序列中CG二核甘酸区域设计特异性的外侧引物,即外侧引物不含CG二核苷酸,先对模板进行外侧引物的扩增,再针对外侧产物设计内侧引物,内侧引物的长度应该在20-30 bp之间,产物长度应控制在300 bp以内[4]。扩增条件均采用TD-PCR法,使PCR反应对修饰后的模板要求降低,目的片段很容易扩出,大大提高了扩增的灵敏度和特异性,扩增效率大大提高。

基因的异常甲基化与许多疾病相关。目前关于基因MLXIPL、PMVK、TRIB3的DNA甲基化与疾病的关系的相关研究在国内外还未见报道。MLXIPL又称为CHREBP(碳水化合物调节元件相关蛋白)是葡萄糖信号途径中的转录因子,在糖和脂肪代谢中发挥重要的作用,它和SREBP-1c(固醇调节元件结合蛋白-1c)协同作用调节糖酵解和脂肪酸合成酶基因的表达[6]。PMVK基因编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMVK),他的cDNA长827 bp,在心脏的表达量是相当高的。他的主要作用是催化甲羟戊酸途径的一个关键步骤,即从ATP中转录一个磷酰基团给5磷甲羟戊酸(M5P)生成5氯喹甲羟戊酸.这一步骤是哺乳动物中类异戊二烯和类固醇合成的唯一途径,这条途径在心血管等疾病的发病中有非常重要的意义[7]。TRIB3是哺乳动物tribbles的同系物,许多疾病的发生都与它的表达产生改变有关,如2型糖尿病的发生、某些炎症反应性疾病、恶性肿瘤的发生。它通过阻滞磷酸蛋白激酶A的活性损害胰岛素信号通路,使病人体内产生胰岛素抵抗[8];它在离体的骨关节炎细胞中表达水平增加,这表明它与骨关节炎的发生有关[9];TRIB3编码的蛋白质可使细胞对TNF和TRAIL诱导的细胞凋亡敏感。研究这些基因启动子区甲基化状态将为很多疾病的发病机制提供一个重要的解释。

综上所述,我们对MLXIPL、PMVK、TRIB3基因启动子区甲基化的研究方法进行了一定程度的摸索,明确了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因的某些区域已发生了甲基化事件,下一步将对实验方法进行一定的改进,扩大样本量,探索此三个基因启动子区甲基化与疾病发病的相关性。

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Detection method formethylation in p romoters ofM LXIPL、PMVK、TRIB3 Genes

QIAN Ran,ZHENGFang,GUOShu-ren,et al.(GeneDiagnosiscenter,Zhongnan Hosipta lofWuhan430071,China)

ObjectiveTo establish time-efficient and sensitive method for detection of the methylation in MLXIPL、PMVK、TRIB3 genes promoter.M ethods The two sets of primerswere used to amplify each target DNA fragments by nest PCR combined touch-down PCR.The PCR productswere further cloned and sequenced.Resu lts The sequencing results showed that unmethylated cytosine residues(C)were transformed to uracil(U),whilemethylated cytosine(mC)remained unchanged.ConclusionIn the present study,methods for the detection ofmethylation states ofMLXIPL,PMVK,TRIB3 genes promoterswere successfully established,which provide a technique for exploring the relation between disease and themethylation of thesegenes.

methylation;MLXIPL;PMVK;TRIB3;nest PCR combined touch-down PCR

Q78

A

1007-4287(2010)08-1166-04

*通讯作者

2009-08-19)