江 飙，郑佳琳，邝贞结，梁红茹，徐 蕙，郭霄峰

(华南农业大学兽医学院，广东广州510640)

狂犬病病毒(Rabies virus，RV)是一种能引起人和动物高度致死性的嗜神经病毒，属弹状病毒科狂犬病毒属，基因组从3'端至5'端依次排列5种结构蛋白，即核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和转录酶蛋白(L)[1]。其中M为RV最小的结构蛋白，共202个氨基酸，占病毒总蛋白的11%。M蛋白能够连接核衣壳和病毒膜，在1位～72位氨基酸残基之间存在一个抗原决定簇，该部位与RV的免疫反应有关。另外，由于糖蛋白的羧基端插入其中，因此它可以直接影响糖蛋白在病毒包膜表面的构型，在病毒形态形成中都起着重要作用[2]，并且平衡、调节病毒的转录与复制[3]。

本研究通过PCR扩增和定向克隆方法构建重组表达质粒，利用大肠杆菌表达出带有6×His标签的RV基质蛋白，为狂犬病诊断方法的建立奠定了良好的基础。

1 材料和方法

1.1 质粒、载体及主要试剂 pHEP-3.0(含有RV的HEP-Flury株全基因序列)由日本国立传染病研究所Morimoto教授惠赠。原核表达载体pQE30、鼠抗RV多克隆抗体、E.coilJM109和M15(pREP4)为华南农业大学兽医微生物实验室保存。凝胶回收试剂盒、鼠抗His单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG购自天根生化科技(北京)有限公司。pMD18-T载体、T4 DNA连接酶、KpnⅠ、HindⅢ为宝生物工程(大连)有限公司产品。KOD plus DNA聚合酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司产品，Prestained Protein Ladder为Fermentas公司产品。His-Trap FF crude购自GE公司。

1.2 引物设计 根据HEP-Flury全基因序列(AB085828)，设计了1对引物，RV-M1(5'-GGGGT ACCATGAACTTTCTATGTA-3')和RV-M2(5'-CCCA AGCTTTTATTCTAAAAGCAGAG-3')。上下游分别引入KpnⅠ与HindⅢ酶切位点，扩增的DNA片段长度为626 bp，涵盖了M基因完整的ORF。

1.3 pQE-M重组质粒的构建 以HEP-Flury株全长基因组质粒为模板，扩增出M的ORF片段，PCR条件为：94℃ 5 min；……