郑静,李丽梅,阳泰,刘阳,刘进,李敏惠,杨淑霞,邹强

(成都医学院1.科研实验中心,2.药学系2006级药物制剂本科班,四川 成都 610083)

基因敲除小鼠(gene knockout mouse)是利用基因敲除技术使正常实验小鼠的基因组特定位点上目的基因失活,经过繁殖筛选后所得到目的基因表达缺陷小鼠,是研究被敲除的目的基因的理想实验材料[1-3]。为了获得可靠的动物模型,基因敲除小鼠在用于实验研究前,必须进行准确、可靠的基因型鉴定,目前所采用的方法主要有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和 Southern杂交。Southern杂交虽然准确性相当高,但是实验步骤比较复杂、工作周期较长,而且花费比较高;PCR法因其具有快速、灵敏、费用低等特点,逐渐取代了传统的Southern杂交,被广泛应用于对基因敲除小鼠基因型的鉴定实验中[4,5]。但在PCR扩增中,如果实验条件不合适,如引物设计不合理、模板DNA质量不高或被污染、反应体系中各成分因子比例失衡、PCR仪温控不准确、人为操作失误等,都容易导致不可靠或无可重复性的PCR扩增结果[6]。

本实验室从美国JAX实验室引进了补体C3基因敲除小鼠,补体C3基因的敲除是通过插入Neo基因后导致补体C3基因失活实现的。在最初对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定实验中,依照常规的引物设计思路,根据插入的Neo基因序列设计PCR引物,但是由于Neo基因是实验室常用的表达克隆载体,我们发现不论在DNA提取过程中还是PCR反应体系配制过程中,都存在模板DNA被外源Neo基因污染的风险,从而造成假阳性的出现。另外,由于PCR扩增反应不充分等因素,经常会出现不清晰的电泳条带,加大了实验结果的不可靠性。……