严孚莹

（中山大学附属第一医院黄埔院区，广东广州 510700）

硝酸酯类药物是治疗冠心病、高血压及心力衰竭的主要药物，因此成为心血管病研究者关注的热点问题。然而大部分研究集中于硝酸酯类药物耐受的机制，而对于耐受是否还具有其他生理效应，对其治疗的疾病缺乏足够认识[1]。20世纪90年代后期，几个大规模的临床试验均表明，硝酸酯类药物对再灌注心肌细胞缺乏有明确的保护作用[2]。目前，多认为ONOO-在硝酸酯类药物耐受加重心肌缺血-再灌注损伤中起主要作用，特别是引起再灌注后心肌细胞凋亡的增加[3-4]。本研究应用离体大鼠心脏低流量缺血-再灌注模型于缺血期给予硝酸甘油（nitroglycerin，NTG，一种 NO供体），观察其对心肌缺血-再灌注损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验器材

1.1.1 仪器与材料 心电图机、手术器械一套、大鼠手术台、改进的Langendorff心脏灌流装置。

1.1.2 药品 托马斯心肌保存液、NTG、碳酸氢盐缓冲液（KHB液）、乙醚、肝素、生理盐水等。

1.1.3 动物 雄性Wistar大鼠（2006年11月～2009年2月）36只，平均体重（313.0±26.8） g。

1.2 方法与步骤

取大鼠，称取体重，乙醚吸入麻醉，在Langendorff心脏灌流装置（改进型）上仰卧位固定，股静脉注射肝素3 mg/kg，迅速进行开胸分离心脏，采用Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液（KHBB）对心脏进行灌流，灌注压为90 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），该操作在1.5 min内完成，超时标本弃用；并以5 Hz（方波：40 mV）电刺激起搏心脏，并保证心脏稳定跳动30 min，检测项目：心率；冠状动脉流量（CF）；左室压力微分（dp/dt），左心室收缩压；左心室舒张末压，即获得压（LVDP）=左室收缩压力－左室舒张末压力，5 min/次。在本研究中将心率与获得压的乘积作为反映心脏机械做功的指标。心脏稳定跳动30 min后，0.125 ml/min灌注泵对心脏进行KHBB灌流液灌流，30 min后关闭，同时再开启Langendorff槽灌流液对心脏再灌注60 min。在用药组，低流量泵中的KHBB灌流液以 4.4×10-3mmol/L NTG 溶液取代[4]。

实验分组：随机将36只大鼠心脏分为两组，即低流量缺血期应用硝酸甘油组（用药组，18只）及不用硝酸甘油组（对照组，18只）。用药组根据是否于再灌注期发生心室颤动又分成心室颤动组及非心室颤动组。因此最终有三组用于结果分析。

1.3 观察指标

采用Gerhardt法对心肌肌酸激酶进行测定[5]。分别收集缺血期心脏灌出液及再灌注期初15 min心脏灌出液进行心肌肌酸激酶测定。NO测定：采用化学发光法测定NO降解产物亚硝酸盐含量。从缺血期总灌出液及灌注期每隔5 min的灌出液中取40 μl进行NO测定。

1.4 统计学处理

应用SPSS 14.0软件包进行统计学分析，计量数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

用药组大鼠心脏中，10只于再灌注期恢复窦性心律（非心室颤动组），8只表现为持续心室颤动（心室颤动组）。18只对照组大鼠心脏于再灌注期全部恢复窦性心律。以上三组心脏之间缺血前心功能参数及NO释放量无显著差异。

2.1 对照组及非心室颤动组大鼠再灌注期心功能恢复情况 见表1。

表1 对照组及非心室颤动组心脏缺血后心功能的恢复情况（）Tab.1 The recovery of cardiac function of control group and non-ventricular fibrillation group after cardiac ischemia()

表1 对照组及非心室颤动组心脏缺血后心功能的恢复情况（）Tab.1 The recovery of cardiac function of control group and non-ventricular fibrillation group after cardiac ischemia()

与对照组比较，*P＜0.05Compared with control group,*P＜0.05

组别 例数 再灌注时间 左心室收缩压 左心室舒张末压 获得压 心率 心率×获得压 冠状动脉流量（min） （mm Hg） （mm Hg） （mm Hg） （次/min）[ml/（100 g·min）]对照组182084.9±1.57.83±0.6660.7±3.286.7±2.852.1±2.476.3±3.44082.5±0.67.27±0.4560.1±1.890.8±2.754.4±1.264.5±2.3非心室颤动组102070.1±4.9*11.22±1.11*40.7±7.8*79.8±4.933.6±7.3*75.2±2.14081.3±2.58.21±0.4460.7±3.588.9±2.953.9±3.369.5±2.2

2.2 心肌肌酸激酶漏出量的比较

再灌注期心室颤动组大鼠心肌肌酸激酶漏出量明显低于对照组及非心室颤动组（P＜0.05）。缺血期心室颤动组大鼠心肌肌酸激酶漏出量亦明显低于非心室颤动组（P＜0.05）。见图 1、2。

图1 三组心脏缺血期肌酸激酶释放量Fig.1 Creatine kinase release of heart in ischemic period in three groups

2.3 用药组与对照组灌注前后离体心脏保存后心肌细胞电镜下表现

图2 三组心脏再灌注期肌酸激酶释放量Fig.2 Creatine kinase release of heart in reperfusion period in three groups

对照组心肌细胞表现为严重的线粒体空泡变性及心肌纤维断裂，用药组心肌细胞几乎未见线粒体空泡变性和心肌纤维的断裂。见图3。

2.4 硝酸酯的作用机制及一氧化氮释放情况

以缺血期与缺血前NO释放量的比值为指标，非心室颤动组大鼠心脏缺血期与缺血前NO释放量比值明显大于对照组[（17.0±4.7）对（7.2±2.1），P＜0.05]。非心室颤动组大鼠心脏缺血期与缺血前NO释放量比值亦大于心室颤动组[（17.0±4.7）对（9.0±1.7），P＞0.05]。 心室颤动组心脏缺血期与缺血前NO释放量比值较对照组无明显增加[（9.0±1.7）对（7.2±2.0），P＞0.05]。 再灌注期任何时点，3 种情况间 NO 释放量均无显著差异。

3 讨论

冠心病患者心肌细胞处于长期的缺氧状态，应用硝酸酯类药物后，产生缺血-再灌注损伤，大剂量使用硝酸酯类药物，出现耐受现象，更加重了心肌缺血-再灌注损伤，特别是增加再灌注后心肌细胞凋亡。大量研究报道，过氧亚硝酸阴离子ONOO-在心肌缺血-再灌注中可能加重心肌的坏死和凋亡[6]。过氧亚硝酸阴离子ONOO-是一氧化氮衍生物，由NO和超氧阴离子（Of）反应生成，是一种重要的氮氧活性氧化合物[7]。心肌细胞凋亡的主要途径是线粒体途径。在心肌缺血期间，呼吸链上的还原型烟酰胺二核苷酸（NADH）脱氢酶受损，导致电子泄漏和活性氧介质（Ros）生成，在活体内通过线粒体呼吸链和NADPH氧化酶产生氧自由基（OFR）。再灌注期间，由于OFR增多和线粒体功能低下，造成ROS“瀑布式”生成[8]。硝酸酯类药物在体内衍生出大量NO。在生物体内，若NO、OFR同时存在，会很快聚集形成ONOO-，生成的ONOO-在碱性环境下是相对稳定的。反应程度通过NO和OFR的生成和分解相对速度可测定[9-10]。过氧亚硝酸阴离子的测定由于生物系统中ONOO-本身复杂的特性，难以隔离和测定，并且ONOO-参与多种反应，很难找出较其他反应更具竞争能力的检测物质。此外，ONOO-和自由基Of及NO的生物效应也不易区分[11]。所以，检测ONOO-一直是一个难题。对于过氧亚硝酸阴离子介导的心肌损伤的实验方案，国内曾有学者设计雄性大鼠尾静脉给予硝酸甘油，测定平均动脉压和离体血管张力以确定是否产生硝酸甘油耐受[12]。

本研究显示，同一剂量的NTG于缺血期灌注大鼠离体心脏，对心肌缺血-再灌注损伤产生两种不同的（相反的）影响，即：对一部分心脏（非心室颤动组大鼠），NTG增加心肌肌酸激酶的漏出量，抑制再灌注期心功能的恢复，说明心肌损伤加重；而对另一部分心脏（心室颤动组大鼠），NTG降低心肌肌酸激酶的释放，表明心肌损伤减轻。在非心室颤动组大鼠心脏，心肌损伤的加重伴随着缺血期心肌组织NO释放量的增加，推测在这种情况下NO是相对过量的，并可能通过以下途径损伤及（或）抑制心肌：①NO与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸盐而损害心肌；②NO与某些涉及细胞基础代谢活动有关的酶（如线粒体呼吸酶）活性中心结合使酶失活；③过量的NO具有直接负性肌力作用[1,7-8]。在心室颤动组大鼠心脏，心肌损伤的减轻并不伴随缺血期NO释放量的明显增加。笔者认为该水平的NO释放有利于保护心肌。耐受大鼠的离体动脉随机接受模拟缺血-再灌注、模拟缺血-再灌注+还原型谷胱甘肽和对照处理，未产生耐受的大鼠随机接受模拟缺血-再灌注或对照处理，为了确定硝酸甘油耐受对缺血-再灌注血管损伤和内皮功能的影响，检测各组灌注液中NO含量、CK和LDH活性，并观测血管收缩能力和对乙酰胆碱的反应。免疫组化标记血管中的硝基化酪氨酸，灰度扫描分析标记强度。结果显示，接受模拟缺血-再灌注处理的硝酸甘油大鼠血管内皮功能显著下降，血管内硝基化酪氨酸含量显著升高。谷胱甘肽显著抑制硝酸甘油耐受的血管损伤。

总之，过氧亚硝酸阴离子具有很强的氧化和硝基化作用，通过对细胞内众多的蛋白、脂质进行修饰，影响其功能，进而对心肌细胞造成损伤。在动物实验中模拟缺血-再灌注模型，利用ONOO-的特殊检测办法，推测ONOO-可能介导了硝酸酯类药物耐受加重心肌缺血-再灌注的损伤。文中产生双重效应的原因可能与不同的大鼠心脏间将NTG转化为NO的量不同有关。同一剂量NTG产生不同水平NO释放量的机制尚不清楚，推测可能与个体心脏间有关将NTG转化为NO的转化酶对NTG的敏感性不同有关[10]。

[1]夏红萍,黄国英,信怡,等.雾化吸入硝酸甘油治疗新生猪急性低氧性肺动脉高压和心肌损害的研究[J].中国病理生理杂志,2007,2(23):664-668.

[2]鲁巍峰,夏强.蛋白激酶与缺血预处理心肌细胞保护作用[J].生理科学进展,1999,30(2):74.

[3]宾建平,李崇信,陈少敏.硝酸甘油对心肌血流灌注直接影响的对比超声评价[J].临床超声医学杂志,2007,9(6):321-325.

[4]余松林,向惠云.重复测量资料分析方法与SAS程序[M].北京:科学出版社,2004:12-15.

[5]金惠铭,王迪洵,王树人.病理生理学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2002:153.

[6]Rastaldo R,Pglim P,CappeUo S,et al.Nitric oxide and cardiac function[J].Life Sci,2007,81(3):779-793.

[7]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2003:1060.

[8]彭龙云,马虹,何建桂.缺血后处理减轻大鼠肥厚心肌缺血-再灌注的观察[J].中华心血管病杂志,2006,34(8):685-689.

[9]Shim YH,KeBten JR.Preconditioning,anesthetics,and perioperative medication[J].Best Praet Res Clin Anaesthesiol,2008,11(22):151-165.

[10]张建华,武征,陈志武.杜鹃花总黄酮预处理对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤的保护作用[J].安徽医科大学学报,2006,41(3):286.

[11]Schulz R,Kelm M,Henseh G.Nitric oxide in myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Cardiovasc Res,2004,4(61):402-413.

[12]赵芳,徐立,许立.参附注射液对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤的保护作用[J].中药新药与临床药理,2007,18(1):17.