曲宪成，程 翠，尚晓莉，曲学伟，张开岳，张 勇

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.烟台市牟平区渔业技术服务中心，山东 烟台 264100）

黄鳝（Monopterus albus），属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）、辐鳍亚纲（Actinopterygii）、合鳃目（Synbranchiformes）、合鳃科（Symbranchidae）、黄鳝属（Monopterus），为温热带淡水鱼类。黄鳝主要分布于我国，以及东南亚、澳洲、中南美及非洲等地区，尤其在我国分布最为广泛[1]。研究表明，黄鳝第一次性成熟为雌性，以后渐渐地发育为雄性，其中间转变阶段叫雌雄间体，这种由雌到雄的转变过程称为性逆转现象[2-3]，黄鳝这种独特的生理现象使它成为研究性别控制机理的一种动物。对黄鳝性腺分化、发育和性别转变机制进行研究显得非常重要。在一定程度上理解和明确黄鳝性逆转的机理，能够人为地控制黄鳝的养殖数量、满足市场对苗种的需要[4]，也能够为理解脊椎动物性决定与性分化的可能机理以及阐明鱼类性别决定和分化的机制，丰富鱼类性别控制的基因调节模式，同时为研究高等脊椎动物性别控制等问题提供参考。

性别决定是确定性别分化的方向，指决定未分化性腺向精巢方向发育还是向卵巢方向发育的过程；性分化是指具有双向分化潜力的未分化性腺经过一系列程序性发生的事件，发育成精巢或卵巢，并出现第二性征的过程[5]。目前，在人和其他动物性别控制的研究方面积累了不少资料，特别是SRY[6]基因和DMY[7]基因的发现，已掀起了对性别控制及其相关基因的研究热潮。性别决定和性转变最终是受基因调控的，人类及其他哺乳动物性别决定与分化是一个以SRY基因为主导的、多基因参与和有序协调的表达过程[8]。Bardoni用Xp21探针研究了DSS（dosage sensitive sex reversal）片段，认为 Xp21上确实存在性反转基因，且DSS的候选基因DAX-1可促进雌性发育[9]。迄今为止，有关报道的性别决定基因包括 SRY/sry、DMY、SOX、AMH、WT-1、SF-1及DAX-1等，但同时也表明性别分化过程还需其他基因的作用，包括上游调控因子和下游调控因子[10]。然而，有关鱼类性别分化发育的分子遗传机制研究甚少，有报道称鱼类芳香化酶等基因的表达可能参与了鱼类性腺分化的调节[11-12]。鱼类在性别决定机制上是多样的，大多数鱼雌雄异体，还有雌雄同体鱼，有些鱼能自然发生性逆转（如黄鳝等），有些能发生天然的雌核发育（如银鲫）。这表明鱼类性别的可塑性很强，可以通过激素等进行性别转变。关于鱼类性别决定的模式有3种：染色体决定、基因决定和环境决定[13-14]。

ACP （Annealling Control Primer） 技 术 是 在DDRT-PCR基础上发展起来的一种对差异表达基因克隆的新方法。该技术的理论基础在于：普通引物的灵敏度和特异性是一个矛盾的双方面，当引物较短时，其灵敏度高，但由于退火温度较低，特异性就会比较差，反之强调特异性，会使扩增的效率（灵敏度)下降。ACP技术使用一种特殊的引物，使得特异性和灵敏度同时兼顾[15-17]。笔者运用ACPDDRT-PCR技术筛选黄鳝不同发育时期性腺基因的差异表达，利用2个随机ACP引物筛选差异表达基因，并对其进行克隆测序分析，以期为进一步研究黄鳝性逆转的机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验所用黄鳝购自上海崇明三沙洪农贸市场。

1.1.2 主要试剂 凝胶回收试剂盒、100 bp DNA Marker、IPTG、X-gal、pMD18-T 载体等购自 TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖、氨苄青霉素、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉购自美著生物技术有限公司；GeneFishingTM Kit购自杭州纽罗西敏生物科技有限公司。

1.1.3 引 物 试验所用的2条ACP随机引物序列如下。ACP2:5＇-GTCTACCAGGCATTCGCTTCA TXXXXXAGGCGATGCC-3＇；ACP3:5＇-GTCACCAG GCATTCGCTTCATXXXXXCCGGAGGATG-3′。

1.2 试验方法

1.2.1 黄鳝性腺发育时期的确定 称取黄鳝体重后，用颈椎切断法处死黄鳝，打开腹腔，观察、取其完整性腺组织，剪取长度约0.5 cm样品，用Bouin氏液固定，石蜡包埋，连续切片（8 μm），HE 染色，拍照，观察[18]，确定各性腺发育时期；其余部分装入1.5 mL离心管，放入液氮中速冻，待样品取完后，转入－80℃保存。

1.2.2 总RNA的抽提 选取卵巢发育IV期和间期性腺作为试验对象。从－80℃冰箱中取出存放于1.5 mL离心管的组织，称取100 mg样本立即加入Trizol reagant试剂1 mL，匀浆后，氯仿抽提、异丙醇沉淀后，适量0.1%DEPC水溶解总RNA，并对RNA进行定性定量分析。

1.2.3 第一链cDNA的合成 取3 μg总RNA利用 T-ACP1(5′-CTGTGAATGCTGCGACTACGATXX XXX(T)18-3′)引物进行反转录。反转录过程如下：80℃孵育 3 min，冰上 2 min后，离心，加入 5×RT buffer 4 μL、2 m mol/L dNTP 5 μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5 μL 和 M-MLV reverse transcriptase(200 U/μL)1 μL，混匀，42℃孵育 90 min、94℃加热2 min，冰上冷却2 min，加入80 μL灭菌双蒸水稀释，－20℃保存备用。

1.2.4 GeneFishingTM PCR GeneFishingTM PCR利用随机引物（arbitrary ACPs）进行PCR扩增。20 μL的PCR反应体系包括：50 ng Diluted first-strand cDNA，2 μL 5 μmol/L arbitrary ACP，1 μL 10μM dT-ACP2(5′-CTGTGAATGCTGCGACTACGAGATX XXXX(T)15-3′)，10 μL 2×SeeAmp ACP Master Mix加ddH 20至20 μL混匀后，进入PCR循环。PCR反应过程如下：94℃5 min；50℃3min，72℃ 2 min；94℃40s；65℃40 s；72℃2 min；40 个循环；72℃10 min；4℃终止。

取PCR产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光下观察，找出差异表达的条带，利用凝胶回收试剂盒对其进行回收纯化。

1.2.5 差异片段的克隆测序 将纯化后的差异片段，与pMD18-T载体相连，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，平板培养、蓝白斑筛选后，经菌落PCR验证呈阳性的菌落扩大培养后送菌液测序。测序结果到NCBI上利用Blast进行同源性分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.2.6 差异片段的RT-PCR分析 对已获得差异表达基因的部分cDNA测序后，根据其部分序列设计引物，并以β-actin为内参，利用半定量RT-PCR技术检测筛选的差异片段在黄鳝卵巢和间期性腺的表达水平。

2 结果与分析

2.1 黄鳝性腺发育时期的选择

通过石蜡切片确定所采黄鳝性腺的发育时期，根据黄鳝性腺发育各期的特点，选取黄鳝发育IV期卵巢和间期性腺组织进行ACP-DDRT-PCR。这两个时期样本的组织结构如图1所示。由图可明显看出在卵巢发育IV期并没有精巢组织发生，而在间期性腺中出现了初级精母细胞，选用这两个发育时期的组织进行比较符合本试验的设计要求。

图1 黄鳝性腺组织切片（10×10）

2.2 黄鳝性腺差异表达基因的筛选

试验利用ACP-DDRT-PCR技术筛选黄鳝发育IV卵巢与间期性腺组织的差异表达基因，通过2条ACP引物筛选到2条差异极显著的基因片段，差异显示结果如图2所示。

图2 ACP DDRT-PCR结果

2.3 差异表达基因的克隆与同源性分析

对上述克隆片段测序结果如图3所示。将序列与GeneBank上的已有序列进行比对，结果显示DEG2与黄鲈卵巢cDNA文库中的一条序列（GeneBank No.GO 657 149.1）高度同源，此序列是在经17α，20β-双羟孕酮诱导后产生的黄鲈卵巢中筛选得到的；而DEG1经Blast比对，并未发现有与其同源性较高的已知序列，因此推测它可能为新报道的基因。

图3 差异片段DEG1和DEG2的部分cDNA序列

2.4 差异表达基因的半定量表达分析

差异表达基因DEG1和DEG2的半定量RTPCR分析结果如图4所示。从图中可以看出两个差异片段在黄鳝卵巢和间期性腺中的差异表达极其显著，与ACP-DDRT-PCR结果一致。

图4 差异片段的RT-PCR分析

3 讨论

ACP-DDRT-PCR技术可用来检测不同样品间的表达差异，着眼于解决目前用来检测基因表达差异方法所面临的问题，如芯片技术和差异显示技术。该技术的优点在于：（1）无假阳性；（2）无需PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），琼脂凝胶法即足够；（3）无需昂贵的检测方法；（4）重复性保证；（5）无需特殊技术；（6）快速经济，ACP技术使得研究者可以在较短时间内确认有效的差异表达基因，不必因为假阳性而浪费时间；（7）大范围的PCR产物，每一个GeneFishing PCR反应产生从150 bp至2 kb长度范围的PCR产物，这不仅提高了鉴别差异表达基因的机会，还为预测基因功能提供了更多的有效序列信息。

笔者采用此项技术来筛选黄鳝不同发育时期性腺的差异表达基因。石蜡切片确定所采样本的发育时期，结果显示卵巢在发育至IV卵黄才大量积累，卵巢接近成熟状态，而且在IV、V、VI期时组织切片观察均未发现明显的雄性组织出现，而在产卵后的间期性腺中可看到初级精母细胞，预计在从IV卵巢到间期的发育过程中，应该有性逆转相关基因的表达，因此选用间期性腺与IV后卵巢进行比较。而在卵巢发育到V期以后已经成熟，卵巢腔内几乎充满了卵泡，对后续的试验会有一定的影响。综合以上原因，最终确定利用黄鳝发育IV期卵巢和间期性腺进行差异表达基因的分析试验。

利用2个随机ACP引物，通过GeneFishing PCR扩增，筛选到2条差异表达显著的基因片断，并对这两条片段进行纯化、克隆、测序，分析后发现在卵巢中高度表达的基因DEG2与黄鲈卵巢cDNA文库中的一条序列（GeneBank No.GO657149.1）高度同源，此序列是在经17 α，20 β-双羟孕酮诱导后，在黄鲈卵巢中筛选得到的。根据所得部分DEG2 cDNA序列设计引物，半定量RT-PCR检测结果同ACP-DDRT-PCR结果一致，该基因在卵巢中表达量极显著高于间期性腺。众所周知，17 α，20 β-双羟孕酮是由促性腺激素作用于卵泡膜细胞而产生的类固醇激素，它是诱导鱼类卵母细胞最后成熟和排卵的介体[19-20]，体外培养试验也证实 17 α，20 β-双羟孕酮是金鱼[21]、虹鳟和白斑狗鱼[22]等卵泡最后成熟有效的诱导剂。而黄鳝IV期卵巢组织在外形上呈较粗大，卵呈橘黄色，且组织切片可以看出，此期卵巢含有I-IV时相卵泡，特别是IV时相卵泡占据大部分卵巢腔，卵巢已接近成熟。由此可见，所研究的DEG2基因对黄鳝卵巢的发育、成熟有重要作用，同时也证实了ACP-DDRT-PCR技术的可行性。

另一条差异表达基因DEG1是在黄鳝性腺转化过程中表达量升高的基因，同样对其进行半定量RT-PCR检测，结果显示与ACP-DDRT-PCR结果一致。但经Blast分析，并未找到其同源性基因，因此认为它是新报道的基因，推测其对黄鳝的性逆转过程有重要的作用，对其功能的进一步研究将有助于认识黄鳝的性逆转分子机制。

综上所述，本文利用一种新的差异显示技术—ACP-DDRT-PCR技术分析了黄鳝IV卵巢和间期性腺基因的差异表达。对所得2个差异表达基因的克隆和分析结果显示，此项技术是可行的。本研究为进一步探索黄鳝在性逆转过程中基因表达的时空调控机理奠定了基础，同时也为研究高等脊椎动物的性别调控机制提供了参考。

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