付世新 ，夏成 ，李鹏 ，沈冰蕾，王长远

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院）

铜是动物和人不可缺少的微量元素之一，体内含量过多或者缺乏都可引起机体代谢发生紊乱而发生疾病。养殖业生产实践证实，在畜禽日粮中添加或静脉注射适量的铜可促生长，可提高养殖业的经济效益[1]。但有关铜促生长的作用机理仍然不清，尤其是有关铜代谢转运过程的研究也比较少见，铜特异性转运蛋白Ctr是铜离子摄入蛋白，Ctr1蛋白在Ctr1-5等5种转运蛋白中转运铜的能力最强，它是铜进入细胞的主要传送蛋白[2，3]，其表达量的多少直接关系到机体铜代谢的平衡，是研究铜如何进行代谢和促生长作用的关键所在[4]。通过在PK15细胞培养液中添加不同浓度的铜，来分析Ctr1基因mRNA表达水平与细胞内主要含铜酶超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性变化的相关性，探讨铜代谢机理，为以后防治人和动物疾病及动物饲料添加剂的研制提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

猪传代肾细胞PK15（本实验室保存）。

1.2 试剂

国产优质分析纯CuSO4，胰蛋白酶、MEM细胞培养基购于hyclone公司、无血清液体营养基购于Gibco公司，含铜 0.002 mg·L-1、L-谷氨酰氨和犊牛血清购于北京鼎国生物技术公司、Olig dT、限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ，反转录酶AMV、Olig dT、焦磷酸二乙酯（DEPC）、DNA质粒提取试剂盒、pMD18-T载体购于TaKaRa公司;总RNA提取试剂盒购于QIAGEN公司;RT-PCR试剂盒,购自Promega公司;DNA回收试剂盒购于杭州维特杰生物技术公司;超氧化物歧化酶检测试剂盒购于南京建成生物工程公司。

1.3 引物设计及合成

根据Genbank中登录的Ctr1基因mRNA序列,设计Ctr1和β-actin的引物。Ctr1基因目的片段大小为530 bp，β-actin大小目的片段大小为321 bp。两对引物分别如下：

2 方法

2.1 Ctr1基因的克隆[5]

2.1.1 cDNA合成及PCR反应

提取PK15细胞的总RNA，并以Olig dT为引物进行RT-PCR，获得cDNA。进行PCR反应，反应条件为95℃预变性3min，94℃变性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环；最后72℃温育10min。

双酶切鉴定结果如图2所示。

各组总RNA的提取同上，取等量的mRNA用Olig dT进行反转录，获得cDNA备用。取1 μL各组cDNA为模板，采用β-actin作为内参，对Ctr1基因的表达量进行测定，重复5次,拍照后经软件分析计算密度比值，进行统计学分析。

依据直线拟方程拟合得到的品位—吨位模式为：y＝-1015.6X+7666.5，拟合值与原始值相关系数R2=0.8369（图7）

2.2 不同铜浓度对Ctr1基因mRNA表达量的影响

依那西普联合环磷酰胺对类风湿性关节炎合并间质性肺炎患者相关指标的影响 ………………………… 陈良敏等（2）：236

超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法（采用南京建成生物工程公司试剂盒）。

2.2.2 Ctr1基因mRNA表达水平的检测[6]

蓝宝石也称“刚玉”，英文叫做“Sapphire”，它的由来有各种说法。有的说源自于梵语“Sauriratna”（魔玉的宝石），有的说是源自阿拉伯海上一个岛屿的名字——Sapphirine。

2.2.1 分组

用1%琼脂糖凝胶电泳PCR产物并回收，经连接转化连到pMD18-T载体上，经蓝白斑法筛选出阳性菌落,用DNA质粒提取试剂盒提取质粒。HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶双酶切质粒。电泳观察酶切结果,鉴定为阳性菌株送上海生工测序。

本项是一个兜底条款。除了上述规定的权利外，评估专业人员在评估活动中还享有相关法律、行政法规规定的其他权利。值得注意的是，按照权利法定的原则，评估专业人员的权利只能由法律、行政法规授予，地方性法规、规章无权授予。法律是指全国人民代表大会及其常务委员会制定的法律规范的总称。行政法规是指国务院根据宪法和法律，按照法定程序制定的有关行使行政权力，履行行政职责的规范性文件的总称。

2.3 细胞内铜离子含量测定

2.3.1 细胞分组和收集

m,andm,respectively.Set the viscous friction factor as l=50.The parameters for PD control are kp=1 and kd=1.8.

目的片段扩增结果见图1。RT-PCR扩增结果分别为530 bp和320 bp左右的片段,与设计的片段大小相符。

2.3.2 样品检测

取处于对数生长期的PK15细胞,接种于6孔培养板上，37℃、5%CO2培养，10 h后更换尤无血清液体培养基2.85mL和150 μL 5种浓度的硫酸铜组成的 混 合 液 。 铜 浓 度 分 别 为 0、7.8、15.6、31.2、62.5 μmoL·L-1（根据生产实践数据确定的实验梯度），编号为实验Ⅰ组到实验Ⅴ组。9 h后，收取各组细胞提取总RNA提取，-80℃保存备用。

3.组织载体 通过从教工党员中选拔骨干教师担任教研室主任，将教工党支部服务关口前移，增加党务与业务的有效距离，为全面实施特色教工党支部建设提供了重要的组织载体。

2.3.3 统计分析

3 结果和分析

3.1 Ctr1基因及β-actinRT-PCR扩增结果

细胞分组同上，于添加铜后10 h细胞收集和计数。用胰酶消化5～7min，细胞计数取相同细胞数后离心，再用PBS将每个样品冲洗3次，洗去细胞表面吸附的铜离子。溶于420 μL蒸馏水中，超声波破碎，待检。

3.2 Ctr1基因的酶切鉴定结果

2.1.2 Ctr1基因的克隆

用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PMD-Ctr1质粒，凝胶电泳显示一条530 bp左右的片段，大小与Ctr1基因相符。经比对同源性达到98%。

3.3 铜对Ctr1基因mRNA表达水平的影响

RT-PCR检测Ctr1基因mRNA表达水平的变化表1。

图1 Ctr1基因的RT-PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of RT-PCR product of Ctr1 gene

图2 PMD-Ctr1质粒双酶切鉴定结果Fig.2 Result of PMD-Ctr1 by double enzyme restriction analysis

表1 不同添加铜浓度Ctr1基因mRNA表达量(±SD)Table 1 Expreesion of Ctr1 gene mRNA effected by copper concentration(±SD)

表1 不同添加铜浓度Ctr1基因mRNA表达量(±SD)Table 1 Expreesion of Ctr1 gene mRNA effected by copper concentration(±SD)

注：同一列标有不同字母表示差异显著（p<0.05）

铜浓度/μmoL·L-1 07.815.631.262.5 Ctr1表达密度值/ng 14.55±0.153a 11.15±0.224ab 7.88±0.172bc 9.93±0.382c 4.76±0.26a β-actin表达密度值/ng 39.64±1.2439.07±2.0240.02±1.5638.98±1.6139.48±2.14 Ctr1/β-actin 值0.367±0.12a 0.285±0.11ab 0.196±0.11bc 0.255±0.24c 0.121±0.12a

从以上结果可以看出，β-actin的表达差异较小，保持均衡不变，加入不同浓度铜后，Ctr1基因mRNA的表达各实验组间存在显著差异，对照组表达量居首，其他组表达量依次为实验Ⅱ组、Ⅴ组、Ⅲ组、Ⅳ组，实验Ⅲ组明显低于实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ组（P<0.05），而与Ⅳ组间差异不显著。

3.4 培养液中添加铜对细胞内CuZn-SOD活性的影响

各实验组细胞内CuZn-SOD活性见表2。

表2 添加不同铜浓度对CuZn-SOD活性的影响(±SD)Table 2 Effection of CuZn-SOD activity in cell by copper concentration in media(±SD)

表2 添加不同铜浓度对CuZn-SOD活性的影响(±SD)Table 2 Effection of CuZn-SOD activity in cell by copper concentration in media(±SD)

注：同一列标有相同字母表示差异不显著（p>0.05）同一列标有不同字母表示差异显著（p<0.05）

细胞内CuZn-SOD活性见表2。各实验组细胞内CuZn-SOD活性显著高于对照组（P<0.05）。其中以添加31.2 μmoL·L-1Cu实验组细胞内CuZn-SOD活性最强，添加15.6 μmoL·L-1Cu组次之。加入铜后10 h各实验组CuZn-SOD活性高于对照组。加入铜后16 h，31.2 μmoL·L-1Cu 实验组细胞内 CuZn-SOD 活性显著高于其它实验组（P<0.05）。加入铜后20 h，15.6 μmoL·L-1Cu 组和 31.2 μmoL·L-1Cu 组显著高于其它组（P<0.05）。加入铜后24 h，各实验组间无显著差异。从实验结果可知，细胞表面Ctr1基因mRNA的表达量与细胞内CuZn-SOD活性呈反向性。

4 讨论

Ctr1是位于哺乳动物的细胞膜上高结合力的铜转运蛋白，Ctr1在细胞代谢中发挥着非常重要的作用，是调节细胞铜代谢的关键物质，该蛋白含量或者Ctr1mRNA的表达量直接关系到细胞铜代谢的稳定，从而影响机体代谢机能。研究表明酵母处于低铜状况时，由于负反馈作用至使Ctr1蛋白的含量升高，而浓度处于0.1～1 μmoL·L-1范围时，换言之处于非中毒铜状态，该蛋白表达量随铜浓度变化升降不明显，但铜离子浓度超过10 μmoL·L-1时，Ctr1蛋白表达量则呈现减少趋势，转运铜的能力降低，细胞则采取吞饮的方式将铜离子转运进细胞内[7]。这说明，铜水平课调控Ctr1蛋白表达量，缺乏时可促进该蛋白的表达，过量则出现Ctr1表达抑制。具体是在mRNA表达过程中还是在翻译过程中增多或减少了Ctr1蛋白的表达量，迄今还没有一个明确的说法，可能同时是存在某些调控Ctr1蛋白基因的转录的物质。同时，在细胞膜上Ctr1蛋白是如何将铜转运进细胞的运作机制还尚不清楚，还有待于进一步研究。

一是进一步加强市场和疫情预警信息，引导养殖户加强生产管理，防控疫病；二是加强市场监管，打击屠宰企业压价行为，减少养殖户损失；三是推广疫病保险，减少养殖户的损失，如安华保险推出非洲猪瘟保险（育肥猪和母猪分别支付保费5元和10元/头，赔付500元和1000元）；四是强化疫区尤其是主产区屠宰能力，减缓疫情发生时出栏压力；五是完善调运监管方案，通过大区域划分等形式实现种猪和仔猪的点对点调运，保障生猪生产的稳定性。

针对以上问题对Ctr1基因mRNA表达对不同铜浓度的反应进行了研究，试验结果证实，Ctr1基因mRNA表达受铜离子浓度的调控，在0～62.5 μmoL·L-1Cu浓度范围内时，呈双相表达反应。与细胞内CuZn-SOD活性检测结果比较，两者呈明显的反相关系，由此可以推断，铜转运蛋白1 mRNA表达水平的减少，可导致铜转运蛋白合成也随之减少，从而引起细胞膜上转运铜离子的数量减少，减少了细胞中毒的可能,对细胞产生了保护性作用。实验Ⅴ组的结果表明，当铜转运蛋白1 mRNA表达量回升时，细胞内的CuZn-SOD活性却反而降低了。这些与刘国文等[8]报道的结果一致，当培养液中铜浓度添加到62.5 μmoL·L-1时，软骨细胞细胞骨微丝、微管、强力纤维均发生不同程度的损伤变形。这个添加浓度导致Ctr1 mRNA表达水平提高是否与骨架结构改变有关，还需进一步探讨。

［1］吴建设，杨汉春，周毓平，等.微量元素铜在动物机体内的代谢研究进展［J］.饲料博览，1998，(10)：11-12.

［2］付世新，罗春海，刘海瑞.铜对猪传代肾细胞(PK15)增殖的影响［J］.黑龙八一农垦大学学报，2008，(2)：47-50.

［3］付世新，张利，齐长学，等.铜对Ctr1基因mRNA表达的影响［J］.黑龙八一农垦大学学报，2009，(12)：29-32.

［4］Jaekwon Lee,Joseph R,Prohaska.Essential role for mammalian copper transporter Ctr1 in copper homeostasis and embryonic development［J］.Proc Natl Acad Sci USA.2001，98，（12）:6842-6847.

［5］金东雁，黎孟枫.分子克隆实验指南［M］.北京：科学出版社，2002.

［6］陈高明，王白凤，李春海.复合定量PCR检测谷光甘肽-S转移酶和多药耐药相关基因mRNA表达水平方法的建立和初步应用［J］.临床检验杂志，1999，17（4）：179-199.

［7］Yuko Yamaguchi-Iwai,Mihaela Serpe,David Haile,et al.Homeostatic regulation of copper up take in yeast via direct binding of MAC1 protein to upstream regulatory sequences of FRE1 and CTR1［J］.JBC,1997,272(28):17711-17718.

［8］刘国文，周昌芳，张乃生，等.铜对体外仔猪软骨细胞增殖和自分泌 IGF-Ⅰ、IGFBP3的影响［J］.中国兽医学报，2002，（9）:515-517.