刘丽花 卜宪岭 李卫红 马学志 周红 王莹莹 刘晓松 党静 刘淑君

我国艾滋病传播渠道正在转变为以性传播为主，男男性接触者(men who have sex with men，MSM)HIV感染率已由2005年的0.4%上升到目前的4.9%，最高的地区甚至达到15%［1］，成为继静脉吸毒人群、有偿献血人群之后的第三大易感人群。为了解MSM人群中HIV-1的亚型分布特点，从分子水平阐明HIV-1流行线路和流行时间，指导对该人群的干预措施的设计和实施工作，对石家庄市2006至2008年报告的MSM感染者的HIV-1 env基因的C2-V3区进行了基因序列测定和分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 51例均经HIV抗体初筛与确认(WB)试验证实为HIV-1抗体阳性的MSM。年龄18～50岁，平均年龄26岁;本市37例，本省其他市10例，外省4例。进行流行病学调查的同时采集0.15%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血5 ml，－20℃保存备用。

1.2 前病毒DNA的提取 取200 μl全血，使用QIACGEN公司QIAamp Blood DNA试剂盒提取前病毒DNA，－20℃保存备用。

1.3 基因片断的扩增 用nest-PCR对HIV-1env外膜蛋白基因C2-V3区及邻近基因区668 bp进行扩增。以ENV-D5、ENVD12为外侧引物进行第1轮PCR反应，25 μl反应体系(10×buffer 2.5 μl，dNTP 浓度 200 μmol/L，Taq 酶 1.25 U，引物浓度0.5 μmol/L，核酸样本 5 μl)，反应条件为 94℃ 5 min，54℃1 min 30 s，72℃ 2 min，3 个循环;94℃ 40 s，54℃ 1 min，72℃1 min，35个循环;72℃ 15 min。取 5 μl第 1 轮反应产物，以ENV7、ENV8为内侧引物，50 μl反应体系，反应条件为 94℃5 min，50℃ 1 min 30 s，72℃ 2 min，3 个循环;94℃ 30 s，50℃40 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃ 10 min进行第2轮 PCR反应。扩增引物见表1。

表1 PCR引物序列表

1.4 目的片段的回收、纯化及测序PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察，选取阳性结果送往上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，测序引物为ENV7/ENV8。

1.5 序列分析 根据测序结果，用美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库中提供的基因分型工具BLAST程序结合系统树分析进行基因型鉴定;用Clustlx软件进行序列排列和比较，用MEGA3.1软件的Neighbor-joining法进行系统树分析，利用Distance程序计算基因距离。……