张瑞莉，刘 娣，梁 尧，张 婧，华育平

（1.黑龙江省农业科学院博士后工作站/东北林业大学博士后流动站 黑龙江 哈尔滨150086；2.东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨 150030）

新城疫（Newcastle disease,ND），又称为亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种高度接触性传染病，本病自1926年首次发生以来，已成为流行广、死亡率高、经济损失重大、危害最严重的禽病之一。尽管对该病在诊断与防制方面进行了大量的研究，并取得了较大的成就，但目前其仍是危害养禽业发展最严重的疫病之一，尚无有效的治疗方法[1-5]。因此，研制高效、低毒、无残留的抗NDV药物是防治本病的一个重要措施。

中药作为天然产物，不但具有抑菌、杀菌和抗病毒作用，而且能够调节、促进机体的免疫功能，同时残毒较低或无残毒，副作用小，不易产生耐药性，应用于防治畜禽传染病，前景极为广阔。鱼腥草是一种应用广泛的中药，其挥发性成分对多种病毒都有抑制作用[6]。本试验对鱼腥草在鸡胚内的抗新城疫病毒活性进行试验研究，为临床进一步研究开发防治新城疫中药提供科学的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 鸡胚

10日龄鸡胚，购自哈尔滨市红星孵化场。

1.1.2 病毒 鸡新城疫病毒（Mukteswar1系），由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，经SPF鸡胚增殖，血凝效价28。

1.1.3 鱼腥草（Houttuynia cordate Thunb.）购于哈尔滨药材市场。

1.2 方法

1.2.1 NDV对鸡胚半数感染量（EID50）测定

将病毒液依次作10倍稀释，接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，每个稀释度接种0.2ml/枚，作四个重复，同时设正常鸡胚对照。置37℃恒温箱内孵化48h，弃去24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及48h活胚的尿囊液，进行HA价的测定[7]。

1.2.2 鱼腥草提取液的制备

称取50g鱼腥草，用500ml水浸泡24h，用武火烧开后文火煎煮30min，用纱布过滤；滤渣加水武火烧开后用文火煮30min，用纱布过滤。将两次滤液合并文火浓缩至50ml。浓缩液先用1500r/min离心10min，弃去沉淀上清液加入3%醋酸壳聚糖溶液，边加边搅拌，100r/min，然后将药液50℃水浴12h，离心取上清液。最后用生理盐水定容到50ml，配成1：1的中药溶液。

1.2.3 药物对鸡胚安全浓度试验

将鱼腥草提取液依次作2倍稀释，接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，每个稀释度接种0.2ml/枚，作4个重复，同时设生理盐水对照。置37℃恒温箱内孵化，弃去24h内死亡胚，活胚继续孵化直至出雏。

1.2.4 鱼腥草在鸡胚内抗NDV活性试验

将鱼腥草中草药提取液用无菌生理盐水配制成含生药1g/ml的药液，然后依次做2倍稀释（即1：2、1：4、1：8倍的稀释）灭菌后进行如下试验：

第一种加药方式：不同稀释度鱼腥草提取液与等量100EID50病毒液混合后，将混合液接种于10日龄鸡胚，每个稀释度5枚，0.2ml/胚，37℃恒温培养48h，测定鸡胚尿囊液的血凝效价。

第二种加药方式：将不同稀释度鱼腥草提取液接种于10日龄鸡胚，每个稀释度5枚，0.2ml/枚，37℃恒温培养2h，然后接种100EID50病毒液0.2ml/，37℃恒温培养48h，测定鸡胚尿囊液的血凝效价。

第三种加药方式：先将100EID50病毒液液接种于5枚10日龄鸡胚，37℃恒温培养2h，再将不同稀释度鱼腥草提取液接种各胚，每个稀释度5枚，0.2ml/枚，37℃恒温培养48h，测定鸡胚尿囊液的血凝效价。

以上试验同时设立病毒及生理盐水对照。

1.3 数据处理

采用Minitab软件进行数据处理，分析各组差异。

2 结果

2.1 NDV对鸡胚半数感染量（EID50）测定结果

记录不同稀释度的病毒液HA试验阳性数和阴性数，按照Reed-Muench方法，计算NDV毒株的EID50为10-4.375/0.2ml。

2.2 鱼腥草对鸡胚安全浓度试验结果

注射不同稀释浓度鱼腥草提取液的鸡胚均正常孵化成雏，说明鱼腥草对鸡胚无毒性。

2.3 鱼腥草抗NDV活性试验的结果

2.3.1 NDV和鱼腥草同时注入鸡胚试验结果

表2-1 NDV和鱼腥草同时注入鸡胚血凝效价的测定结果

NDV和鱼腥草同时注入鸡胚时，鱼腥草原液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异极显著（p＜0.01）；鱼腥草21倍稀释液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异显著（p＜0.05）；鱼腥草22倍稀释液和23倍稀释液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异不显著（p＞0.05）。

2.32 鱼腥草NDV接种后注入鸡胚试验结果

表2-2 鱼腥草于NDV接种后注入鸡胚血凝效价的测定结果

鱼腥草于NDV接种后注入鸡胚时，鱼腥草21倍稀释液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异极显著（p＜0.01）；鱼腥草原液和22倍稀释液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异显著（p＜0.05）；鱼腥草23倍稀释液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异不显著（p＞0.05）。

2.33 鱼腥草先于NDV注入鸡胚试验结果

表2-3 鱼腥草先于NDV注入鸡胚血凝效价的测定结果

鱼腥草先于NDV注入鸡胚时，鱼腥草22倍稀释液和23倍稀释液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异极显著（p＜0.01）；鱼腥草21倍稀释液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异显著（p＜0.05）；鱼腥草原液血凝效价较病毒对照组血凝效价差异不显著（p＞0.05）。

4 讨论

新城疫病毒可在鸡胚中增殖，并释放到尿囊液中。新城疫病毒在一定条件下能使鸡红细胞发生肉眼可见的血凝现象。如在鸡胚内注入药物后，尿囊液不出现血凝现象，则表示药物在鸡胚内对新城疫病毒具有明显抑制作用[8]。鱼腥草为三白科植物蕺菜的全草，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效，对多种细菌、病毒具有较强的抑制作用。研究显示，鱼腥草具有抑制流感病毒活性作用，鱼腥草抗流感病毒作用的有效成分为其挥发油，作用机制是通过干扰病毒包膜而杀灭流感病毒[9]。本试验结果显示，鱼腥草提取液和NDV同时加入、先加入鱼腥草提取液后接种NDV及先接种NDV后加入鱼腥草提取液的鸡胚都现出了血凝减轻的现象，这可能是鱼腥草挥发性成分发挥了抗病毒作用，抑制了NDV在鸡胚内的增殖。

本试验中，病毒和中药同时加入鸡胚的目的是观察药物对病毒的直接抑制作用；先接种病毒后加中药目的是观察药物能否对已进入鸡胚内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放；先加中药后接种病毒目的是观察药物能否与侵入。结果显示，三种不同加药方式的鸡胚尿囊液都出现了血凝减轻的现象，表明鱼腥草提取液在鸡胚内既能直接抑制NDV增殖，又能阻止NDV的吸附，同时也能抑制NDV的生物合成及成熟释放。

本试验中，病毒和中药同时加入鸡胚时，药液的浓度越高抗病毒活性越好；先接种病毒后加中药时，21倍稀释和22倍稀释的药液抗病毒活性更好；先加中药后接种病毒时，抗病毒活性由弱到强依次为原液、21倍稀释、22倍稀释、23倍稀释。结果表明，鱼腥草提取液在鸡胚内抗新城疫病毒活性与其加药方式及深度有关。

[1]甘孟侯.中国禽病学.北京：中国农业出版社，1999

[2]DouglasKO,LavoieMC,KimLM,et al.Isolation and genetic characterization of avian influenza viruses and a Newcastle disease virus from wild birds in Barbados:2003 -2004.Avian Dis,2007,51(3):781-7

[3]QinZM,Tan LT,XuHY,et al. Pathotypical characterization and molecular epidemiology of Newcastle disease virus isolates from different hosts in China from 1996 to 2005. J Clin Microbiol,2008,46(2):601-11

[4]赵书海，赵玉华，赵瑞须.2002.新城疫发生后的控制办法.中国兽医杂志.38（7）：57

[5]刘昌进，董以爱，于夕模.2003.卵黄抗体的使用方法.山东家禽.9：23

[6]朱宇同，杨汝才，苏章，等.鱼腥草挥发油提取物抗病毒作用的初步研究[J].中草药，1983，14（7）：25-26

[7]殷震，刘景华.动物病毒学.北京：科学出版社，1997，329～331

[8]于海，刘玉洁，常维山.中药大黄抗新城疫病毒的试验研究.中国畜牧兽医，2005，32（2）：50-51

[9]莫冰.余克花.板蓝根和鱼腥草抗流感病毒研究.江西医学院学报.2008,48（4）：44-45