王玉军，纪伟东，李永平

（黑龙江粮食职业学院粮油工程系，哈尔滨 150080）

大豆低聚糖(Soybean Oligosaccharides，SBOS)是大豆籽粒中可溶性寡糖的总称，也可泛指其它豆科作物种子所含有的低聚糖总称，主要成分是蔗糖（Sucrose）、棉子糖（Raffinose）、水苏糖（Stachyose）。蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖以α-1，2糖苷键结合而成。而棉子糖和水苏糖则是在蔗糖结构中的葡萄糖之C6位以α-1，6糖苷键又分别结合了1分子和6分子的半乳糖，其均属于非还原性糖。其中棉子糖和水苏糖为功能性低聚糖，其功能特性主要表现在：促进双歧杆菌的增值，减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生，防止腹泻和便秘，改善血清脂质，保护肝功能，降低血压，增强免疫力，抗肿瘤，合成维生素，防龋齿，低能量或无能量[1]。

大豆低聚糖的测定方法有很多种，其中较准确的方法是气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。这两种方法都具有既可定性又可定量的优点。其中HPLC法不但分离效果好，重现性及回收率均比GC法好[2]。利用HPLC测定SBOS方法也有许多报道[3]，如利用carbohydrate色谱柱测定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉籽糖[3]，及选用Hypersil-NH2色谱柱测定方法[4，5]、μBondapak—C18柱测定方法[6]、反相液相色谱法(RP-HPLC)[7]等方法，本文对采用carbohydrate色谱柱的HPLC方法同时测定大豆低聚糖粉中水苏糖和棉子糖的方法进行了研究，结果表明该方法灵敏、准确、可行。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

试验仪器：Agilent1100型高效液相色谱仪、示差折光检测器(G13162A RID)、Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6×150mm,5μm)、SUPELCLEAN ENVI-18化学工作站。

试验试剂：水苏糖、棉子糖标准品为Sigma公司色谱纯产品；乙腈为色谱纯；大豆低聚糖粉购自陕西森弗生物技术有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6×150mm,i.d.5μm)；流动相为乙腈-水(75∶25,V∶V)；流速1mL/min；柱温30℃；RID检测器，检测池温度35℃；进样量10μL。

1.3 标准溶液配制

分别称取水苏糖、棉子糖标准品（含量均≥98%）各0.02g置于5mL容量瓶中，用去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀。水苏糖、棉子糖溶液浓度分别为4mg/mL，经0.45μm滤膜过滤，滤液供HPLC分析用。

1.4 样品制备

准确称取2.00g大豆低聚糖粉，用去离子水溶解并稀释定容至100mL，混匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液供HPLC分析用。

1.5 测定方法

1.5.1 标准曲线的制备 分别取大豆低聚糖标准溶液 5.0μL、10.0μL、15.0μL、20.0μL、25.0μL（相当于水苏糖、棉子糖质量20μg、40μg、60μg、80μg、100μg）注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，测定各组分色谱峰面积，以标准糖质量对相应的峰面积作标准曲线。

1.5.2 样品测定 在相同的色谱分析条件下，取10μL试样溶液注入高效液相色谱仪分析，测定各组分色谱峰面积，与标准曲线比较确定进样液中水苏糖、棉子糖含量。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

采用示差折光检测器，采用carbohydrate色谱柱，同时对大豆低聚糖粉中的水苏糖、棉子糖进行测定，试验结果表明，选用carbohydrate色谱柱进行检测效果较好。

2.2 流动相的选择

本实验以乙腈-水为流动相，通过改变乙睛与水的比例优化色谱条件。以乙腈-水分别为80∶20、75∶25、70∶30(V∶V)测定了混合标准溶液和大豆低聚糖中棉子糖、水苏糖含量和分离情况。实验表明，随着乙腈浓度的增加，糖蜜中的糖分离程度提高，当流动相中乙腈和水的比例为80∶20时分离效果最佳，但是分离时间较长。当流动相中乙腈和水的比例为70∶30时分离效果不好，葡萄糖和相邻峰的分离度较差。当流动相中乙腈和水的比例为75∶25时分离效果很好，且保留时间较理想。综合考虑各个因素,本实验采用流动相的比例为75∶25。

2.3 色谱分离

采用上述分析条件，柱温选定为30℃，棉子糖和水苏糖分离良好，两者的保留时间为12.30min、22.90min，标准品和样品色谱图见图1、图2。

2.4 标准曲线和检出限

以1.5.1中所述方法对混合标准液进行液相色谱分析，以峰面积为纵坐标(y)，标准糖质量(μg)为横坐标(x)，作校正曲线并进行线性回归。实验结果表明：棉子糖和水苏糖分别在1～10mg/mL、1～10mg/mL范围内线性良好，相关系数分别为0.9925、0.9971，以3倍信号比(S/N)为检出限(LOD)，棉子糖为0.43mg/mL，水苏糖为0.39mg/mL，回归方程见图3、图4。

2.5 精密度测定

取同一大豆低聚糖粉样品，按照1.4进行处理，重复进样5次，进行精密度实验，结果棉子糖和水苏糖的RSD分别为2.50%和0.16%(见表1)。

表1 检测方法精密度实验结果

2.6 回收率实验

在滤液中加入一系列不同浓度的混合标准液，按上述方法处理后进行HPLC分析，棉子糖和水苏糖的平均回收率为95.8%和96.0%，RSD为1.57%和1.81%，结果见表2。

2.7 样品测定

任意选取三份大豆低聚糖粉样品，按上述方法处理后进行测定分析，测定结果见表3。

表2 添加回收率实验结果（n=5）

表3 大豆低聚糖粉样品测定结果

3 结论

本实验建立了采用示差折光检测器(RID)，色谱柱为Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6mm×150mm,5μm)，流动相为乙腈-水(75∶25,V∶V)，流速1.0mL/min，柱温30℃，同时测定大豆低聚糖粉中棉子糖和水苏糖含量的高效液相色谱分析方法（HPLC）。实验结果表明：棉子糖和水苏糖分别在1～10mg/mL、1～10mg/mL范围内线性良好，相关系数分别为0.9925、0.9971；2种糖的相对标准偏差(RSD)分别为1.57%、1.81%(n=5)，平均回收率分别为95.8%、96.0%。该方法适用于大豆低聚糖粉中棉子糖和水苏糖含量的检测。

［1］李本楠，甘卉．大豆低聚糖理化性质及其生理功能[J]．中国实用医药，2009，(9)：238-239．

［2］唐春江,邓放明,王乔隆，等．大豆低聚糖的研究进展[N].农产品加工·学刊,2008，(2):33-37.

［3］董爱军，张英春，杨鑫，等．高效液相色谱法测定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉子糖[J]．食品工业科技，2008，(12)：245-247．

［4］GB/T 22491-2008大豆低聚糖[S]．

［5］马莺,骆承祥,吴昊.高效液相色谱法测定大豆乳清中大豆低聚糖[J].分析化学,1999,27(3):367.

［6］张延伸，张东祥，刘国忠，等．高效液相色谱法测定大豆低聚糖[J]．食品工业，2000，(2)：45-46．

［7］朱建华，杨晓泉．反相液相色谱法同时测定大豆制品中的功能性低聚糖—水苏糖和棉子糖[J]．粮油加工与食品机械，2005，(11)：75-76．