邴飞虹，张国斌，苏彦奇

(湖北中医学院中药资源与中药复方重点实验室，湖北 武汉 430065)

蜈蚣三七系毛茛科银莲花属植物林荫银莲花 Anemone flaccida Fr.Schmidt的根茎，别名地乌，性温，味辛、微苦，具有祛风湿、助筋骨、消肿止痛的功效[1]，民间常用于风湿疼痛、跌打损伤。本实验室将蜈蚣三七有效部位中提取分离得到的总皂苷制成抗类风湿的中药新药[2]，目前已进入临床研究阶段。蜈蚣三七总皂苷的有效成分之一3－O－α－L－吡喃鼠李糖(1→2)－β－D－吡喃木糖－齐墩果酸－28－O－α－L－吡喃鼠李糖(1→4)－β－D－吡喃葡萄糖(1→6)－β－D－吡喃葡萄糖苷，由Zhao Li等[3]从蜈蚣三七中首先分离得到，本室定名为W3[4]，并研究证实W3在蜈蚣三七中含量最高[5－6]。笔者从蜈蚣三七中提取出W3，并比较了蜈蚣三七总皂苷、W3及其苷元齐墩果酸对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，为寻找免疫活性成分和进一步研发中药新药提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药及动物

Agilent1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Agilent Zorbax SB－C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);CO2恒温培养箱(美国Thermo公司);TS100－F－PH倒置荧光相差显微镜(日本尼康公司);AC100－110型酶标仪(瑞士TECAN公司)。D101大孔吸附树脂(天津骨胶厂);薄层层析和柱层析硅胶G(100～200目，青岛海洋化工厂)。胎牛血清(深圳达科为生物技术有限公司，批号为20061203);DMEM/F12培养基(Hyclone公司，批号为NRC0005)，加入胎牛血清配成体积分数为10%的完全培养液;淋巴细胞分离液(Axia－Shield公司，批号为 1002380，密度 1.077 g/mL);刀豆蛋白(ConA，Sigma公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，Amresco公司)，用DMEM培养液配成 0.5%的溶液，0.22 μm滤膜除菌;二甲亚砜(DMSO，Kehaoze公司)。甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。蜈蚣三七采自湖北省五峰县，经湖北中医学院中药鉴定学教研室陈科力教授鉴定为林荫银莲花 Anemone flaccida Fr.Schmidt的根茎。齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所);雷公藤片(三九黄石制药厂，批号为 060401，每片含雷公藤甲素 33 μg)。W3、齐墩果酸、蜈蚣三七总皂苷均按W3计，雷公藤片按雷公藤甲素计，均以DMEM培养液配成所需浓度的溶液，经0.22 μm滤膜除菌后4℃保存备用。昆明种小鼠，清洁Ⅱ级，雌雄各半，体重(20±2)g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号为SCXK(鄂)2003－0005。

1.2 实验方法

1.2.1 W3的制备

取蜈蚣三七粗粉1 kg，乙醇加热回流提取，滤液于60℃减压浓缩至棕色干浸膏。将此浸膏混悬于水中，加入水饱和的正丁醇萃取，提取液于80℃减压浓缩至干，残留物加水溶解，滤过，滤液上D101型大孔树脂，水－乙醇系统洗脱，收集65%乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至干，残留物加甲醇溶解，加入丙酮使其沉淀完全，得蜈蚣三七总皂苷30 g。将此总皂苷以甲醇溶解，加入硅胶G混匀，干燥，按样品∶硅胶G(1∶30)上硅胶干柱，氯仿－甲醇－水(20∶10∶1)系统洗脱，经硅胶G板薄层原位酸水解法检查，采用氯仿－甲醇－水(7∶4∶1)展开剂系统展开，显色剂采用10%硫酸、105℃下加热显色。收集甲醇洗脱液，浓缩至干，浓缩物以60%甲醇溶解，用SBC18反相色谱柱进行制备分离，以乙腈－水系统洗脱，经紫外检测分离得白色无定形粉末W3，约80 mg。采用高效液相色谱法测定，W3纯度为 93.25%。

1.2.2 脾淋巴细胞的制备与培养

脱颈椎处死小鼠，无菌制备单个脾细胞悬液，用培养液洗涤、悬浮沉淀，沿管壁缓缓加至淋巴细胞分离液上，离心，取液体中间层呈云雾状的淋巴细胞，用培养液洗涤，以含10%胎牛血清的完全培养液悬浮沉淀，置37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.3 静止脾淋巴细胞的增殖试验[7]

淋巴细胞培养12 h后，倒置显微镜下观察细胞状态，加入完全培养液至细胞含量107/mL。在96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液 100 μL，培养 12 h 后，分别加入 100 μL 系列浓度(0.001，0.01，0.1，1，10，100 μmol/L)的药物，空白组加入等体积的 DMEM培养液，每个样品均设3个复孔，共培养24 h后，每孔加入MTT液20 μL，继续培养 4 h，吸弃上清液，每孔加入 100 μL DMSO，在旋涡混合仪上振荡5 min，酶标仪490 nm处检测 A值。

1.2.4 ConA诱导的脾淋巴细胞增殖试验[7]

淋巴细胞培养12 h后，倒置显微镜下观察细胞状态，加入完全培养液至细胞含量107/mL。在96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液 100 μL，培养 12 h 后，分别加入 50 μL 系列浓度(0.01，0.1，1，10，100 μmol/L)的药物，再加入 50 μL ConA(终质量浓度 10 μg/mL)，空白组加入等体积的DMEM培养液，每个样品均设3个复孔，其他操作方法同1.2.3项下操作。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 对静止脾淋巴细胞增殖的影响

结果见表1。各剂量的W3、齐墩果酸及蜈蚣三七总皂苷对静止脾淋巴细胞的增殖均无明显影响，与空白组比较均无显著性差异(P＞0.05);高剂量(≥10 μmol/L)雷公藤片则对静止脾淋巴细胞的增殖有明显抑制作用，与空白组比较差异显著(P＜0.05)。

表1 各种质量浓度的不同药物对静止淋巴细胞增殖的影响(X ± s，n=4)

表2 各种质量浓度的不同药物对ConA诱导的淋巴细胞增殖的影响(X ± s，n=4)

2.2 对ConA诱导的淋巴细胞增殖的影响

结果见表2。各剂量的齐墩果酸对淋巴细胞增殖均无明显影响;当剂量不小于0.1 μmol/L时，W3对淋巴细胞增殖表现出较强的抑制活性(P＜0.05);当剂量不小于1 μmol/L时，蜈蚣三七总皂苷及雷公藤片对淋巴细胞增殖均有抑制作用(P＜0.05)。

3 讨论

对蜈蚣三七总皂苷的含量测定研究表明，W3为蜈蚣三七的代表性成分，含量约占总皂苷的27.5%。关于蜈蚣三七有效成分的免疫活性，国内外尚未见文献报道。本研究通过比较蜈蚣三七总皂苷、W3及其苷元齐墩果酸对小鼠体外脾淋巴细胞增殖反应的影响，首次探讨了蜈蚣三七有效成分W3的免疫活性。

类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，机体免疫应答过程中T淋巴细胞的过度激活、增殖和浸润，加重了关节炎症反应和滑膜组织增生。通常淋巴细胞增殖反应被认为是反映机体免疫功能的有效指标之一。脾淋巴细胞中含有T淋巴细胞和B淋巴细胞，ConA作为T淋巴细胞有丝分裂原，主要促进T淋巴细胞增殖。因此采用ConA刺激法来研究蜈蚣三七有效成分W3的免疫活性。结果显示，较高剂量的W3对静止淋巴细胞未产生毒性反应，而对ConA诱导的淋巴细胞增殖活性有显著的抑制作用，这与其在治疗类风湿性关节炎中抑制T细胞增殖、调节机体免疫机能的功用一致。蜈蚣三七中大多皂苷类成分的苷元均为齐墩果酸，二者的理化性质亦相似。本研究中，齐墩果酸对静止态及ConA诱导的淋巴细胞增殖均无明显影响，说明苷元不连接糖基则无抑制或促进淋巴细胞增殖的作用。

可见，蜈蚣三七总皂苷及有效成分W3的免疫调节作用特点在于对正常机体的免疫功能无明显影响，对已处于免疫激活状态的机体则有显著的抑制作用，且具高效、低毒的优点[8－10]，预示W3具备了较强的免疫活性和深入开发的潜力，但对免疫系统的作用机理尚待进一步研究。

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社，2002:802.

[2]邴飞虹，张国斌.国家五类新药——地乌风湿安胶囊[J].湖北中医杂志，2005，27(1):48－49.

[3]Zhao L，Chen WM，Fang QC.Two new oleanane saponins from anemone flaccida[J].Planta Medica，1991，57(6):572 － 574.

[4]邴飞虹，韩林涛.从林荫银莲花提取的地乌皂苷W3标准品及制备工艺:中国，CN200510018363.9[P].2005 －10－19.

[5]邴飞虹，易艳东，张国斌.蜈蚣三七有效成分W3单次给药后在小鼠体内的药代动力学研究[J].中国药科大学学报，2006，37(6):523－526.

[6]邴飞虹，易艳东，张国斌.林荫银莲花总皂苷中W3在大鼠体内的药代动力学研究[J].中国药理与临床，2009，25(1):23－25.

[7]苗明三.大枣多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生IL－1α及脾细胞体外增殖的影响[J].中药药理与临床，2004，20(4):21－22.

[8]江 俊.地乌总苷对佐剂性关节炎大鼠特异性免疫功能影响的实验研究[J].中药材，2002，25(3):194 －195.

[9]邴飞虹，张国斌，邓成志.蜈蚣三七提取物对胶原性关节炎小鼠病理改变的影响[J].湖北中医学院学报，2008，10(2):3－5.

[10]邴飞虹，张国斌，邓成志，等.蜈蚣三七提取物对小鼠胶原性关节炎免疫作用机理的初步研究[J].中国免疫学杂志，2008，24(8):716－720.